突变型聚酮合成酶酮还原酶域的表达及序列分析.pdfVIP

2011，Vo1．28No．8亿 与 生 物 互狸 Chemistry Bioengineering doi：10．3969／j．issn．1672—5425．2011。08．O11 突变型聚酮合成酶酮还原酶域的表达及序列分析 李凌凌 。吕早生 ，李 涛，沈 辉 (武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081) 摘 要 ：为验证糖 多孢红霉茵聚酮合成酶模块 1的酮还原酶域 EryKR1中的控制底物特异性位 点，以糖 多孢红霉茵 基 因组 DNA为模板 ，用重叠 PCR技术扩增 出 6和 a7之间的氨基酸残基 RHGVIEMP对应 的核苷酸序列被替换 的 EryKR1酶域 DNA片段 eryKR1M，并克隆到表达栽体 pET-28a上 ，构建 了质粒 pET-eryKR1M，转化到 Escherichiacoli BL21(DE3)后 ，获得 了重组菌株 E．coliBL21(pETeryKRiM)。经 IPTG诱导后 ，SDS电泳分析表 明重组大肠杆 菌 E．coliBL21(pET～eryKR1M)中的重组蛋 白质表达量 占全 茵胞 内可溶性 蛋 白质 的 5．7 。E．coliBI21(pET— eryKR1M)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基 因的重组茵 E．coliBL21(pET—gdh1)进行双重组茵耦舍 ，对 4一氯 乙酰 乙酸 乙酯 、苯 乙酮、2一辛酮和环 己酮 4种底 物进 行转化 还原 ，利 用 气相 色谱 分析 转化液 ，结果显示 突变型 的重组 菌 E．coliBI21(pET—eryKR1M)失去野生型重组茵 E．coliBL21(pET—eryKR1)2还 原环 己酮的能力 ，结合 EryKR1酶域 与 放线菌素聚酮还原酶 ActKR的氨基酸序列比对和二维结构 比较 的结果 ，推测 a6和 7间氨基酸残基 RHGVIEMP为 EryKR1酶域 中的底物结合 口袋组成单元 ，对酶活性保持非常重要 。 关键词 ：酮还原酶域 ；聚酮合成酶 ；糖 多孢红霉菌；生物催化 ；序列分析 中图分类号 ：Q 789 Q815 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2O11)08—0036—07 聚酮化合物 ，是广泛存在于 自然界 中的结构 多样 通过 比较芳香族聚酮的酮还原酶与其它短链脱氢酶超 的次生代谢产物 ，具有很大的医药应用价值 ，包括很多 家族成员的结构差异，提出芳香族聚酮的酮还原酶 (如 抗生素和抗真菌药。聚酮是由聚酮合成酶 (Polyketide 放线菌素聚酮还原酶 ActKR)与其它 SDR家族成员 synthase，PKS)催化一系列的小分子前体进行重复缩 的差异为 a6和 7间的 10个氨基酸残基 ，该 区域是 合反应而合成的。目前为止 ，至少有 3种不同类型的 SDR家族的底物结合 口袋的一部分，是最不保守的序 聚酮合成酶口]，其中 I型聚酮合成酶是一种模块 型的 列 ，负责控制底物特异性。20O6年，Keatinge—Clay 多功能酶，如负责催化合成红霉素 A中大环 内酯环的 等 ]研究了糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块 1的酮还原 6一脱氧 红霉 内酯 B合成 酶 (6-Deoxyerythrono1eB 酶域 EryKR1的结构 ，提 出了该酶域与其它酶域间的 synthase，DEBS)，DEBS有 6套结构和功能相近的模 界限、多聚体的组成方式 以及控制催化立体选择性还 块 ，每套模块催化完成一轮碳链 的延伸和还原 ，其上有 原反应的机制等，但未提及该酶域的底物结合口袋等 。 酮合成 酶 (Ketosynthase，KS)、酰基转 移酶 (Acyl 同年 Bali等_l6在大肠杆菌中异源表达 了糖多孢红霉 transferase，AT)和酰基载体蛋 白(Acylca