异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立.pdfVIP

第 30卷第 3期 河 北 医 科 大 学 学 报 Vo1．30 No．3 2009年 3月 J()URNAIOFHEBEIMEDICAIUNIVERSITY Mar． 2009 ·273 · · 论 著 · 异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立 马忠锋 ，柴家科。，杨红明 ，梁黎 明。，许 明火 (1．河北省秦皇岛市第一医院外科 ，河北 秦皇岛066000；2．解放军总医院第一附属医院烧伤整形科 ，北京 100037) 【摘要】 目的 寻找表皮细胞和成纤维细胞体外培养、鉴定、冻存与复苏的可行方法 。方法 酶消化法分离表 皮细胞和成纤维细胞 ，分别进行原代 、传代培养 ，并对细胞进行冻存与复苏 。表皮细胞进行广谱角蛋 白一异硫氰酸荧 光素 (PAN—FITC)免疫荧光染色，成纤维细胞行波形蛋 白一FITC免疫荧光染色 。结果 表皮细胞呈克隆样增长 ，以 后细胞逐渐互相融合 。PAN—FITC染色均为阳性 。成纤维细胞 的体外生长活力强，波形蛋 白一FITC染色呈阳性 。 结论 酶消化法是表皮细胞和成纤维细胞体外培养 的重要方法 ，本实验为构建组织工程皮肤奠定了基础 。 【关键词】 表皮 ；细胞 ；成纤维细胞 ；细胞培养技术 doi：10．3969／j．issn．1007—3205．2009．03．019 【中图分类号1 R329．2 【文献标识码】 B 【文章编号1 1007—3205(2009)03—0273—02 表皮细胞和成纤维细胞体外培养技术是皮肤组 过滤 ，离心弃上清 ，加入无血清培养基成为细胞悬 织工程学关键’技术之一。本 实验 旨在 寻找细胞培 液 ，行 台盼蓝染色 。约0．5×10 个细胞接种于 25 养 、鉴定、冻存与复苏的可行方法 ，建立稳定 的培养 mL培养瓶 ，置于 CO。孵箱 中，每 2天换液 1次。 条件 ，为组织工程皮肤 的构建奠定基础 。 1．3．2 PAN—FITC荧光免疫染色 ：当细胞达到亚 融合后 ，PBS洗涤 ，以95 酒精 固定贴壁细胞 。以 1 资 料 与 方 法 小 鼠抗人 PAN广谱角蛋 白抗体为一抗 ，FITC一山羊 1．1 材料 ：中性蛋白酶一Ⅱ(Dispase一1I)、胰蛋 白酶 、 抗小 鼠单克隆抗体为二抗 ，进行免疫荧光染色鉴定。 乙二胺 四 乙酸 (ethy!enediaminetetraceticacid， PBS代替一抗做空 白对照。 EDTA)、I型 胶 原 酶 、二 甲基 亚 砜 (dimethyl 1．3．3 表皮细胞 的传代培养 ：当表皮细胞达 到 sulphoxide，DMSO)、台盼蓝 (美 国Sigma公司)、改 60 ～7O 融合后 ，加入混合消化液。待大部分表 良伊 格 尔 培养 基 (dulbeccoSmodifiedeagleS 皮细胞悬 浮，立 即加入等量含 1O 胎 牛血清 的 medium，DMEM)、无血清培养基 、胎 牛血清 (美 国 DMEM 液 。离心弃上清 ，加入无血清培养基成细胞 Gibco公 司)。小 鼠抗人广谱 角蛋 白抗体 (PAN 悬液 ，按 1：3的比例接种于培养瓶 中，同原代培养 cytokeratin)、波形蛋 白抗体及 FITC一山羊抗小鼠单 法进行培养 。 克隆抗体 (武汉博士得公司)。 1．3．4 表皮细胞的冻存与复苏 1．2 取材 ：标本来 自包皮环切术所切下的健康人包 1．3．4．1 冻存 ：消化亚融合状态的表皮细胞成细胞 皮，均取得患者 同意，年龄 8～21岁 。将皮片修剪成 悬液 。离心弃上清，加入 已配制好 的冻存保护液 中 0．5cm×1．0cm大小 。