昆明小鼠胚胎收集时问和培养液对囊胚内细胞团集落分离培养的影响.pdfVIP

繁箍 ·Reproducfio[3andPhysiology 20{2每 幕48卷 麓7期 昆明小鼠胚胎收集时问和培养液对囊胚内 细胞团集落分离培养的影响 张翠平，邱小燕，肖 雄 ，赵海龙，邓玉金 ，李跃民 (西南大学，动物科技学院胚胎工程实验室，重庆 400716) 摘 要 ：本研究旨在筛选获取优质 ICM 集落的实验方法。以昆明系小鼠为实验动物 ，采集 3．5、4d和 4．5d的胚 胎，分别移入DMEM培养液、DMEM+白血病抑制 因子(LIF)和小鼠胎儿成纤维细胞共培养体系中进行培养，观 察比较内细胞团(ICM)从透明带中孵出的时间、孵化囊胚贴壁情况以及 ICM 集落形成情况。结果表明：妊娠3．5d 的胚胎 61％为桑椹胚，需要经过 4～5d的体外培养才能形成ICM集落；妊娠4d的扩张囊胚经过 3～4d的共培养 后形成 ICM 集落；妊娠 4．5d的孵化囊胚经过 1-2d的共培养即可形成 ICM 集落；ICM 形成率以妊娠 4．5d的胚 胎最高，显著高于妊娠 4d和 3．5d的胚胎(PO．01)，但妊娠 4．5d冲出孵化囊胚数量显著降低(P0．01)；小鼠胎儿 成纤维细胞共培养体系优于DMEM和DMEM+LIF培养液。因此 ，采集妊娠 4d的昆明小鼠胚胎，选择小鼠胎儿 成纤维细胞共培养体系，在体外培养3-4d，能够有效分离培养出可用于胚胎干细胞研究的优质ICM。 关键词：胚龄；培养液；ICM；昆明小鼠 中图分类号：$814．8 文献标识码 ：B 文章编号：0258—7033(2012)07—0026—03 胚胎干细胞 (embryonicstemcells，ES细胞 )是具 供依据 。 有高度分化潜能的、从早期胚胎 内细胞 团(ICM)或 1 材料与方法 原始生殖细胞 (PGCs)经体外分离培养而获得的多 能性细胞系lI_2]。研究Es细胞不仅是为了定向诱导 1．1 实验动物 昆明系6～8周龄清洁级小 鼠，体重 分化出替代病人衰老死亡细胞 的同类型细胞 ，实现 28～32g，由重庆 中药研究所提供 。 应用 Es细胞治疗疾病的 目的；而且也有望应用 Es 1．2 主要试剂与仪器 DMEM培养基 (Gibco公 细胞重新构建出机体的组织器官用于器官移植治 司)，胎牛血清 (FBS，杭州 四季青)，白血病抑制 因子 疗 ，这将对医学和生物工程等领域的发展产生广泛 (LIF，Chemicom公司)，丝裂霉素 一C(Gibco公司 )， 而深远的影响[蚓。体外培养小鼠胚胎获取 ICM并将 碱性磷酸酶(AKP，南京建成生物制品研究所)等。 其进一步培养为Es细胞是 目前获取Es细胞的主 倒置显微镜 ：重光 ，重庆光电仪器有 限公司；CO 培 要途径。因此，如何有效培养出ICM集落是影响Es 养箱：Forma3131，USAThermoFormaCO2。 细胞获取效率的关键环节。收集胚胎的时间和胚胎 1-3 MEF的分离培养及饲养层 的制备 参考文献 培养过程 中所使用 的培养液均能够影响优质 ICM 8【】的方法分离培养胎儿成纤维细胞 ，经丝裂霉素 c 集落的形成，以上2个影响因素众多报道很不一致 。 处理后待用。 随着胚龄 的增加获得 ICM就越容易，但胚龄太大时 1．4 胚胎 的收集与培养 分别将妊娠 3．5、4d和 会造成胚胎损失，这可能与胚胎在子宫已经着床无 4．5d的小 鼠在无菌条件下取出子宫，用 1mL无菌 法冲出有关。本实验主要从收集胚胎的时问和优选 注射器吸入 0．4～0．6mLM：操作液，从子宫角端进 分离 ICM的培养液人手，研究筛选获取优质 ICM集 针，用镊子固定针头，将 M快速推人子宫腔 ；冲胚操 落的实验方法，为进一步有效分离培养 ES细胞提 作完成后将其移至解剖镜下，收