奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析.pdfVIP

维普资讯 《黑龙江畜牧兽医))2008年第3期 l5 奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析 曹世诺，于龙政，薛书江，贾立军，柴方红，张守 (延边大学 农学院动物医学系，吉林 龙井 133400) 1 中图分类号：$852．7 文献标识码：A 文章编号：1004—7034(2008)03—0015—03 关键词：牛瑟氏泰勒虫；P33表面蛋 白基因序列；克隆；序列分析 摘 要：研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白的基因序列设计合成 l对引物，用 PCR方法扩增出了牛瑟氏泰勒虫的基因片段，将该基因纯化后连接到pMD18一T载体上，进行序列测 定和分析，并用此方法对延边某奶牛场 lO头奶牛进行了检测。结果表明：1O份样品中9份为阳性， 所扩增的 目的基因核苷酸长为868bp，共编码283个氨基酸；该段基因片段与牛泰勒虫韩国株核苷酸 序列同源性为99．4％，氨基酸 同源性为99．3％。 牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科泰勒属的瑟氏泰勒 dNTP混合物(均为2．5mm01／L)4 L，引物TSP1和 虫(Theileriasergenti)寄生于牛体内引起的以高热、贫 rI1sP2(10pmol／L)各 2 L，LATaqDNA聚合酶 血、出血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状的 0．5 L，去离子水31．5 L，DNA模板 5 L。反应条 一 种血液原虫病…。牛瑟氏泰勒虫 P33表面蛋 白在 件为 95℃5min；94℃1min，57℃ 1min，72℃ 红细胞感染阶段作为一种膜内蛋白表达在虫体表面， 1min，35个循环；最后 72℃ 10min。然后用 1％琼 是具有较好免疫原性的抗原蛋白，是检测和预防牛瑟 脂糖凝胶电泳鉴定PCR诊断结果。取其中1份阳性 氏泰勒虫病理想的基因。试验应用该基因片段设计 为DNA模板，进行 100o,L体系扩增，然后再用 1％ 的引物对延边某牧场的中国荷斯坦奶牛进行了PCR 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并用 DNA凝胶回收 扩增、基因克隆、序列分析及蛋 白结构预测，为开展牛 试剂盒回收 目的片段。 瑟氏泰勒虫分子生物学研究奠定了基础。 1．4 PCR产物的克隆及鉴定 1 材料与方法 将回收的目的片段与pMD18一T载体连接，用制 1．1 材料 备好的BL21大肠杆菌感受态细胞进行转化后涂于 奶牛血液 lO头份，采 自延边某牧场的中国荷斯 含氨苄西林LB固体培养基，37℃培养l2一l6h后， 坦奶牛。DNA凝胶 回收试剂盒、LATaqDNA聚合 挑取 白色菌落接种于加有Amp的LB培养液中培养。 酶、pMD18一T载体、限制性内切酶 BamH I和 Sph 次 日用碱性裂解法提取质粒后分别用 BamH I和 I，均购 自TaKaRa公司。其他试剂为进 口或国产分 SphI酶切及PCR扩增筛选阳性重组质粒后，送至 析纯产品。 上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。 1．2 引物设计与合成 1．5 TS—P33基因编码区的序列分析 根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫 P33表面 将所扩增的TS—P33基因序列应用Blastn进行 蛋白基因序列 (D87198)，应用 PrimerPremier5．0和 比对 ，分析它们之间关系。 Oligo6．0软件设计 1对引物，序列为上游引物 TSP1： 1．6 TS—P33蛋白结构分析 5一TATGTTGTCCAAGAGATCGT一3 (1—20bp)；下 将扩增的奶牛TS—P3