干细胞微观结构观察的解决方案.pdfVIP

Marketing 天美（中国）科学仪器有限公司 TECHCOMP (CHINA) LTD. 中国北京朝阳区天畅园7 号楼1、3 层 TEL:010 FAX:010 E-MAIL:techcomp@techcomp.cn 干细胞微观结构观察的解决方案 干细胞是具有趋向性、自我更新和多向分化潜能的特殊细胞。应 用干细胞特性 ,治疗多种疾病具有广泛的前景。 近年来，随着神干细胞体外培养模型的建立，干细胞的研究正逐 渐成为生命科学领域新的研究热点。然而目前对干细胞的应用仍停留 在实验阶段，在探索干细胞分化过程中，对微观结构变化的观察具有 重要意义。 目前对于干细胞的微观观察主要采取光学显微镜和电子显微镜 两种手段。分辨率更为优异的电子显微镜是科研不可或缺的工具。电 子显微镜主要分为扫描电子显微镜和透射电子显微镜。扫描电镜可用 于观察样本的表面信息，用于获取样品表面的凹凸形貌像和成分像； 透射电镜可穿透样品，获得样品的二维投影像，用于观察样品的内部 结构。结合扫描电镜和透射电镜，可基本实现对干细胞分化全过程的 细致全面的微观结构观察。 研究神经干细胞定向分化的诱导因素及其分化机制,精确调控神 经干细胞高效的诱导分化为产生专门递质的功能神经元或特定类型 的神经胶质细胞,可以实现神经干细胞移植治疗中枢神经系统( central nervous sys2 tem, CNS)疾病的目的。因此,神经干细胞在神经损伤修复 和退行性病变的治疗中具有广阔的应用前景,为中枢神经系统疾病的 治疗提供了一条新途径。但是, 目前关于神经干细胞的光电镜结构报 道较少,这里我们以神经干细胞为例，简单介绍对神经干细胞的培养 及样品制备方法。 1. 实验动物 成年健康SD 大鼠。 2. 培养基 在分离培养神经干细胞的过程中,用下列2 种不同培养基。 ( 1)生长培养基: DMEM /F12 ( 1 ∶1, Hyclone) , 2%B27 (Gibco) , 20 ng/ml bFGF ( Sigma) , 20 ng/ml EGF ( Sigma) , 100 U /ml 青霉素, 100μ Marketing 天美（中国）科学仪器有限公司 TECHCOMP (CHINA) LTD. 中国北京朝阳区天畅园7 号楼1、3 层 TEL:010 FAX:010 E-MAIL:techcomp@techcomp.cn g/ml 链霉素。( 2 ) 分化培养基: DMEM /F12 ( 1 ∶1, Hy2 clone) , 10% FBS (杭州四季青) , 100 U /ml 青霉素, 100μ g/ml 链霉素。 3. 神经干细胞的分离培养 取E14 d SD 大鼠,颈椎脱臼处死,无菌条件下打开腹腔,暴露子宫, 从子宫角处分离胎鼠。取出胎鼠,放入无菌 D2Hank 液中反复冲洗,在 冰台上、解剖镜下剥离皮肤肌肉等组织,取出脊髓。用眼科剪轻轻剪 碎脊髓, 0. 25%胰蛋白酶消化3～5 min,缓慢吹打, 200 目铜网过滤,离 心, 1000 r/min, 5 min,弃上清,加生长培养基,混匀后台盼兰染色计数, 以5 ×105 个/ml 密度接种入25 cm2 培养瓶中,置入37℃的5%CO2 培 养箱中培养,光镜下观察细胞的形态及变化。细胞培养 6～7d,待原代 克隆形成后,用机械分离法将这些神经球制成单细胞悬液, 以 5 ×104 个/ml 密度再次接种于25cm2 培养瓶中。以后每6～7d 传代一次,方法 同前。 4. 电镜观察 取生长状态良好的神经干细胞,在培养1 d、7 d 后收集入离心管 中, 2000 r /min,离心 15 min,弃上清液收集,制备透射电镜样品。使用 日立透