生化分离技术第七章层析.pptVIP

第二节 凝胶过滤层析 2．脱盐 GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分于质量物质。例如，经过盐析沉淀获得的蛋白质溶液中盐浓度很高，一般不能直接进行离子交换层析分离，可首先用GFC脱盐。此外，GFC还用于溶解目标产物的缓冲液的交换。生物物质的分离纯化需要多步操作，上一步操作所用缓冲液有时不适合于下一步单元操作的有效实施(例如，某些盐离子抑制蛋白质在亲和吸咐剂上的吸附)，必须进行缓冲液的交换。若将缓冲液A换成缓冲液B，可先用B液冲洗GFC柱，上样后用B液洗脱，即可完成缓冲液的交换。 第二节 凝胶过滤层析 3．相对分子质量的测定 GFC中溶质的分配系数m在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小，分配系数与相对分子质量Mr之间存在如下关系： m＝a-blogMr （7-1） 在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数(或洗脱体积)与相对分子质量的对数呈线性关系，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。首先用标准蛋白质如细胞色素C(12500，指分子量，下同)、肌红蛋白(16900)、胰凝乳蛋白酶(23200)、卵白蛋白(45000)和血红蛋白(64500)等分别进行凝胶过滤层析实验，确定分配系数与相对分子质量的关系式。然后测定未知物质的洗脱体积(分配系数)，就可推算其相对分子质量。不过，GFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。 第二节 凝胶过滤层析 4．凝胶层析的特点 与其他层析法相比，GFC的最大特点是操作简便，凝胶过滤介质相对价廉易得，适合于大规模分离纯化过程。因此，GFC在生物大分子的分离纯化过程中应用最为普遍，尤其被广泛应用子分离纯化过程的初级阶段以及最后成品化前的脱盐。GFC的具体优点如下： ①溶质与介质不发生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100％； ②每批操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； 第二节 凝胶过滤层析 ③作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高，与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高； ④分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 与其他层析法相比，GFC的不足之处在于： ①仅根据溶质之间相对分子质量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小； ②经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作(如超滤、离子交换和亲和层析等)后使用。 第三节 离子交换层析 一、原理与操作 1．离子交换层析的原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的不同而发生差速迁移，从而实现溶质分离的洗脱层析法。 阴离子交换基有DEAE(二乙胺乙基，通用范围：pH≤8.6，QAB(季铵乙基)；阳离子交换基为CM(羧甲基，适用范围pH＞4)，P(磷酸基)和SP(磺丙基)。各种凝胶过滤介质键合上述离于交换基，即可制备相应的离子交换剂。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Sepharose、TSKget PW、Toyopearl、Bio-GelA和纤维素等。 第三节 离子交换层析 2．离子交换层析的操作 离子交换层析的装置主要包括蠕动泵、离子交换层析柱、紫外检测器及部分收集器等。进行离子交换层析时，先将树脂用展开剂处理，使树脂层析剂转变成展开剂离子的型式；然后将溶解在少量溶剂（通常为展开剂）中的试样加到层析柱的上部，再通入展开剂展开，流出液分步收集，测定其含量。在分离制备中，根据检测结果，分段合并各步收集液，并进行浓缩提取。IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(1inear gradient e1ution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(step wise elution)。 第三节 离子交换层析 在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程中，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。GFC之外的层析操作多采用线性梯度洗脱法或逐次洗脱法，只是流动相组成的变化情况各不相同。 线性梯度洗脱法的优点是流动相离子强度(盐浓度)连续增大，缺点是需要特殊的调配浓度梯度的设备。逐次洗脱法的优点是利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，