国境口岸类鼻疽菌的实时荧光定量PCR检测方法.docVIP

国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的荧光PCR检测方法 Detection of Burkholderia pseudomallei by real-time PCR at frontier ports （送审稿） 前 言 本标准依据GB/T1.1-2009给出的规则编写。 本标准起草单位：中华人民共和国出入境检验检疫局中华人民共和国出入境检验检疫局 本标准主要起草人：、、 国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测的对象，标本的采集、运输和保存，操作方法及结果报告。 本标准适用于国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的筛选检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 类鼻疽伯克霍尔德菌 Burkholderia pseudomallei 类鼻疽伯克霍尔德菌属革兰氏阴性菌, 是引起人及动物严重感染性疾病类鼻疽的病原体。该菌广泛分布于东南亚和澳大利亚北部的水及土壤中。我国疫源地主要分布于海南、广东、广西、湖南、贵州、福建、香港、台湾等省区。人群对该菌普遍易感，临床症状表现复杂多样，分为急性败血症型、亚急性型、慢性型和亚临床型，最严重的症状是合并肺炎和急性败血症。该病病死率高。 3.2 荧光PCR fluorescence polymerase chain reaction 又称为实时荧光PCR（real-time PCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。 3.3 Ct值 cycle threshold 即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。 缩略语 下列缩略语适用于本标准： 4.1 Bp Burkholderia pseudomallei 类鼻疽伯克霍尔德菌。 4.2 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 4.3 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 4.4 Taq酶 Taq DNA polymerase Taq DNA聚合酶 4.5 FAM 6-carboxyfluorescein 6-羧基荧光素 4.6 MGB minor groove binder 小沟结合物，一种荧光淬灭基团。 4.7 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核苷三磷酸 检测对象 5.1 疑似类鼻疽伯克霍尔德菌感染的临床标本如血液、痰液、尿、粪便、局部病灶及脓性渗出物。 5.2 环境污染标本如水样、泥土。 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB 19489的规定。PCR防污染措施按WS/T 230和SN/T 1193的规定执行。 仪器和器材 7.1 实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。 7.2 生物安全柜。 7.3 高速台式离心机（离心速度13800g以上）。 7.4 台式离心机（离心速度900g)。 7.5 漩涡振荡器。 7.6 恒温水浴锅。 7.7 高压灭菌锅。 7.8 低温冷藏、冷冻冰箱。 7.9 微量可调移液器（10μL，100μL，200μL，1000μL)及配套带滤芯吸头。 7.10 Eppendorf管（1.5 mL)。 试剂 8.1 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。实验用水应符合GB/T 6682-2008 4.1中一级水的规格。 8.2 生理盐水 灭菌蒸馏水和NaCl配置浓度为0.9%的生理盐水。 8.3 4%NaOH 灭菌蒸馏水和NaOH配置浓度为4%的NaOH溶液。 8.4 DNA提取液 含0.9% NaCl和0.1% EDTA-Na2的混合液。 8.5 实时荧光