入境环保微生物菌剂检测方法 第3部分：巨大芽孢杆菌 意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 入境环保用微生物菌剂检测方法 第3部分：巨大芽孢杆菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 3: Bacillus megaterium 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本是根据GB/T1.1-1993《标准化工作导则 第一单元：标准的起草与表述规则 第1部分：标准编写的基本规定》的要求编写的。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。境环保用微生物菌剂检测方法 第3部分：巨大芽孢杆菌 范围 本标准规定了。 本标准适用于。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 方法原理 取适量入境环保用微生物菌剂，将菌剂中的菌进行活化、分离，对该菌进行形态学和生理生化试验，并进行，三项实验结果。 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。：见附录A中A.1章：见附录A中A.2章TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.3章10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L氯化钾（KCl）15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。dNTP: dATP、dTTP、dGTP、dCTP。TBE：54 gTris，27.5 g硼酸，800 ml去离子水溶解，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)定容至1 L。Taq DNA聚合酶。细菌基因组DNA提取试剂盒。DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。电子天平（感量0.01 g）。36 ℃±1 ℃、50 ℃±1 ℃ 恒温水浴锅。 台式离心机（最高转速15 000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 头：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。90 mm。1 g（mL）样品加入到100 mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个营养琼脂平板，36 ±1 ℃培养18～24 h。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 挑取平板上3～5个白色不透明菌落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，36 ±1 ℃培养18～24 h，再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，36 ±1 ℃恒温培养箱内增菌培养18～24 h进行生化鉴定。 形态学及生化鉴定 革兰氏染色及芽孢染色 将7.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色和芽孢染色，镜检。 生化鉴定法 取7.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管100 μL。 巨大芽孢杆菌形态学及生化特征： 巨大地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，细胞直径＞1 μm1。 巨大芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 巨大芽孢杆菌 接触酶 + 氧化酶 + 厌氧生长 - 葡萄糖 + 木糖 +/- L-阿拉伯糖 +/- +/- 利用葡萄糖产气 - + 硝酸盐还原 +/- 50℃生长 - pH5.7生长 +/- 7%NaCl生长 +/- + 明胶液化 + 细菌模板DNA的提取 直接提取法 取7.2中菌液2 mL加到2 mL无菌离心管中，10000 rpm离心2分钟，尽量弃净上清，沉淀加入TE100 μL、10 mg/ml溶菌酶100 μL，37 ℃温育30 min，12000 rpm离心2分钟，沉淀加入TE缓冲液600 μL重悬，再加入15 mg/ml蛋白酶Ｋ25 μL，55 ℃温育1 h后沸水浴10 min，12000 rpm离心5分钟，取上清保存于－20 ℃保存以待检测。 有机溶剂提取法 取7.2中菌液2 mL加到2 mL无菌离心管中，10000 rpm离心2分钟，尽量弃净上清，沉淀加入TE缓冲液570 μL重悬，然后加入10 mg/ml溶菌酶100 μL，37 ℃温育30 min，再加入10 %SDS30 μL，65 ℃温育10 min，加入等体积的酚混匀，12000 rpm离心10