动物肝脏DNA的提取与检测.docVIP

《分析技术》开放性实验方案设计 动物脾脏DNA的提取与检测 生物技术061 洪晓芬 沈月月 余爱娟 方佳 【实验目的】 了解从动物组织中提取DNA的原理，掌握DNA定磷法、紫外法、二苯胺法检测及琼脂糖平板电泳操作方法。 【实验原理】 生物体组织细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分与蛋白质结合，以核蛋白——脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。 将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸 (EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。 DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的５端），必须获得无RNA污染的DNA制品。通过下述方法，可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析。 【实验流程】 DNA纯度的检测 ↗ DNA提取 → DNA纯化 → DNA的分子量的测定 → DNA纯品提取干燥 ↓ ↘ DNA的浓度测定 DNA的含量测定 【器材与试剂】 （一）器材 1. 捣碎机 2. 离心机 3. 手术剪 4. 离心管 5. 刻度吸管 6. 烧杯（100ml） 7. 玻棒 8. 新鲜动物肝脏 9.石英比色皿 10.UV-240紫外分光光度计 11.水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55℃水浴；沸水浴；微量移液器 （二）试剂 （1提取）1. 5mol/L NaCl溶液 NaCl 146.15g溶于蒸馏水稀释到500ml。 2. 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTANa2溶液 NaCl 4.09g及EDTANa2 27.9g溶于蒸馏水稀释到500ml。 3. 25% SDS溶液 SDS 25g溶于45%乙醇100ml中 苯酚氯仿-异丙醇混合液 苯酚：氯仿:异丙醇=25：24:1（V:V） （2纯化）1