重组人表皮生长因子的分离与纯化的研究.pdfVIP

科技论坛 ·23· 重组人表皮生长因子的分离与纯化的研究 商安新 （哈药集团生物工程有限公司，黑龙江哈尔滨 150000） 摘 要：本实验采用凝胶法来纯化人表皮生长因子, 并定量测定了人表皮生长因子(hEGF)。人表皮生长因子与经过离子交换柱、SDS- PAGE 及凝胶图象扫描分析系统的标准品相互对比。结果表明，在 SDS凝胶上能够得到与标准样品hEGF 一样清晰的单条带, 得 到的产品纯度可高于94%, 检出限能够达到 1ug/mL。本实验方法能够很好的在线检测出人表皮生长因子, 同时本方法对其它蛋白质分 离的在线检测也具有参考价值。 关键词：人表皮生长因子；分离；纯化；在线检测 人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor,hEGF)是一种最 与进样量的关系,结果显示样品出现的峰随着进样量的体积增加而明 早被发现的，也是最早应用于临床上的多肽生长因子，该因子由53个 显变宽,所得的峰面积逐渐增加,计算得标准曲线方程为A=2.0801 氨基酸残基组成,相对分子量约为6200Da [1]。hEGF具有多种生物学 m-0.398,式中A表示峰面积,m表示hEGF质量(ug)。 功能,其不仅能够促进表皮和上皮细胞的增殖，以及增强蛋白质及DNA 5.2hEGF的分离纯化及浓度在线检测。经研究发现目标产物 的合成，而且还能够抑制胃酸分泌等多种作用。因此，在临床上其可应 hEGF的相对分子质量6200Da，而其它蛋白质的最小相对分子质量 用于外科伤口的救治、皮肤和角膜移植、溃疡的治疗和促进伤口愈合等 为18000Da，两者相距约10000Da以上,因此可以应用凝胶对hEGF [2]。 进行分离。经过反复实验我们总结得到优化后的分离条件为:柱床高度 自从有研究者在人的尿液中分离并纯化出人表皮生长因子以来， 16cm,线性流速6cm/h,进样量1mL。我们应用此条件进行层析，结果 关于研究人表皮生长因子的报道就越来越多，并且发展很迅速。该种因 显示在两个大峰群中间有1个小的峰,其保留的体积与我们在相同条 子不仅可以从天然来源中分离纯化出来，而且近些年来有研究者利用 件下所测到的标准hEGF样品的保留的体积一致,然后再用SDS- 基因工程技术人工分离纯化出人表皮生长因子[3]。 PAGE凝胶来进行检测,最后确认该小峰为hEGF的峰,其余杂质峰基 目前,hEGF的定量检测方法主要有放射免疫分析法、放射受体分 本是可以分开。 析法、酶联免疫吸附分析法、酶免疫分析法、反相HPLC法和免疫荧光 根据标准曲线我们取低浓度的回归方程可得到hEGF的绝对含量 技术等 [4]。同时以上的几种方法都有其各自的特点和不同的条件局限 为156.22ug,其质量浓度可达到156.22ug/mL；然后我们又用高浓度的 性,而且都难用于在线检测的过程。 回归方程计算,其得到hEGF的绝对含量为157.25ug,质量浓度可达 本文在实验时使用AKTAexplorer100对蛋白质进行分离纯化 到157.25ug/mL。综上所诉,两个方程的计算结果基本达到一致。经 时发现,该检测系统自身带有一种软件，该软件不但能够与各种层析柱 AKTAexplorer100系统检测后,得到1mL该样品中hEGF的峰面 结合来研究多种蛋白质的分离流程,而且还可以通过出峰面积的大小 积占整个峰面积的比值为2.69%,此即该盐析液中hEGF的相对含量( 比较精确地表示出蛋白质量的多少,这为蛋白质定量检测奠定了基础。 %)。 本文以此对hEGF进行了分离纯化的在线定量检测的探索研究。 5.3分离结果的验证。将上述分离后的收集液进行冷冻干燥,得到 1仪器与试剂 白色的hEGF粉末。对所得粉末与hEGF的标准品用阴离子交换预装 1.1仪器。分离纯化快速开拓系统(AKTAexplorer100)、进样柱、 柱进行了分析,得到hEG