第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导.pptVIP

病案讨论 免疫增殖性疾病 某患者，男，48岁。主述“乏力，脸色苍白，骨骼疼痛、背痛”六个月，体检发现：皮肤黏膜苍白，局限性骨骼压痛，伴肝脾肿大。辅助检查发现：（1）血象：Hb 8.2 g/dl，WBC血小板 红细胞、白细胞和血小板镜检形态学正常，分类可见幼粒、幼红细胞，红细胞呈缗钱状排列；（2）骨髓象：增生活跃，浆细胞占20％，并发现形态异常的骨髓瘤细胞。其余各系细胞大致正常；（3）骨X线片、CT或同位素扫描：可发现多部位穿凿样溶骨性病变或广泛性骨质疏松。 问 题 根据以上初步检查结果，该患者初步诊断为什么疾病？ 根据你的理论知识，该患者还需做哪些免疫学检验项目？可能结果如何？ 与哪些疾病需进行鉴别诊断？ 温州医学院 陶志华 * * 第九单元 免疫增殖性疾病的免疫学检验 概 述 免疫增殖病通常是指以浆细胞、淋巴细胞和巨噬细胞异常增生为特征的疾病，其表现往往有免疫功能异常及免疫球蛋白质和量的变化。 与免疫学检验最为密切的是B淋巴细胞异常增殖或其他导致免疫球蛋白异常的免疫球蛋白病，免疫球蛋白病主要表现为高免疫球蛋白血症。 当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，一般先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本－周蛋白定性作为初筛实验。 如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析和免疫球蛋白分类鉴定。 实验一血清免疫固定电泳实验 实验目的 本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习 通过实习，熟悉血清免疫固定电泳的实验过程及注意事项；掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白的基本原理与临床意义。 实验原理 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂和各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面的各自泳道上，经孵育让固定剂和抗血清在各自泳道对应的凝胶内渗透并扩散，若有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白质，仅保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。根据电泳移动距离分离出单克隆组分。 试剂与器材 Acide Violet染色液：用1L 10%冰醋酸溶解Acide Violet。 脱色液：用1L蒸馏水溶解Citric Acid Destain。 清洗液：8L蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。 电泳仪：spife 3000全自动电泳仪。 Spife 3000全自动电泳仪 操作步骤 样本处理： 用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清第一泳道样本稀释3倍，第二至第六泳道样本稀释5倍。 区带电泳 上样 胶片准备 电泳 沉淀反应 加抗血清 洗涤、烘干 着 色 结果分析 对染色烘干后的胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单克隆免疫球蛋白条带。如图12-1所示, 其中sp泳道为血清蛋白参考道，由下至上分别为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为IgG、IgA、IgM、κ、λ抗血清泳道。 注意事项 标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。 总免疫球蛋白的水平＞20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平＜5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。 某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后，可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样情况下，加25μl液化剂于75μl血清中，混匀15s。然后按规定程序继续进行。 某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加25μl还原剂（1％β-巯基乙醇）于75μl血清混匀并令其反应至少15min（至多3h 后按规定程序继续进行。 在电泳之前，凝胶与电泳槽的贴合面充满电泳介质，并确保两者之间无气泡。 在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。 染色之前的胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤，以出去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景色。 临床应用 本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。通常用于单克隆Ig增殖病，单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。 免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。 思