蜂蜜中烟曲霉素残留量测定 液相色谱串联质谱法编制说明.docVIP

《蜂蜜中烟曲霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》编制说明 一、任务来源 本标准是按照国家认证认可监督管理委员会下达的，由河北出入境检验检疫局承担的行业标准修订任务。本标准名称为《蜂蜜中烟曲霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，计划编号为2010B150。 二、编制依据 本标准是按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规则》、GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》和行业标准SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》（以下简称《基本规定》）的要求编写的。 三、研究背景 中国蜂蜜出口消费地多数是日本、美国、欧盟等世界贸易组织与环境委员会的成员。2002年欧盟以氯霉素含量超标为由，终止从中国进口蜂蜜。虽然2005年初恢复了中国对欧盟国家的出口，但欧盟成员国对中国蜂蜜存在排斥心理；?此外，2006年1月1日开始欧盟国家实施新的《欧盟食品及饲料安全管理法规》，特别要求进口食品必须符合新食品安全法的标准，否则不准进入欧盟市场，中国蜂蜜出口再次面临严峻考验。?日本每年从中国进口蜂蜜数量占其蜂蜜进口总量的90%以上，中国对日出口蜂蜜占中国蜂蜜出口总量的40%以上。值得关注的是，2006年5月，日本执行的《食品中残留农业化学品肯定列表制度》，明确设定了进口食品、农产品中可能出现的700多种农药、兽药和饲料添加剂的近5万暂定标准，对其未设标准而欧美国家也无标准可参照的农药推行“一律标准”，大幅抬高了进口农产品的门槛。发达国家和地区不断提高农兽药标准壁垒，中国蜂蜜出口存在隐忧，提高蜂蜜“绿色”质量是摆脱困境的关键。 自从2006年全世界各地出现了大规模的蜂群崩解失调症（CCD）,蜂巢成员大量消失，蜂巢只剩女王蜂，蜂卵及幼蜂的现象。养蜂业面临空前危机，影响所及造成许多农业地恐难自然授粉，严重影响花果收成，甚至连农业产品都可能大规模歉收。美国加州大学旧金山分校的研究团队宣布，已经找到了引发这场蜂群消失的可能致病因子：蜜蜂微孢子虫（nosema ceranae）。微孢子虫是一种单细胞的原生动物，寄生在昆虫和鱼类体内，已知有50多种。蜜蜂微孢子虫寄生于成蜂的消化道，患病蜂往往因消化不良，营养不良而死去。普遍认为，烟曲霉素可以有效的治疗蜜蜂感染微孢子虫病[1]。烟曲霉素是由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的发酵培养液中分离得到的一种抗生素，它被用来防止蜜蜂感染微孢子虫病[1]，也被用来治疗鱼类[2]的一些与微孢子虫有关的疾病。但是烟曲霉素有致癌作用并且具有可诱发遗传毒性作用。目前，国内外没有蜂蜜中烟曲霉素最大残留限量（MRL）要求，因此，建立一种高灵敏度的蜂蜜中烟曲霉素残留检测方法是十分有必要的。 根据国内外文献查新，国内外对烟曲霉素残留的检测主要有酶联免疫法（ELISA）[3]，高效液相色谱法(HPLC)[4-5]和高效液相色谱串联质谱法(LC/MS)[6-16]。采用固相萃取技术对蜂蜜样品前处理，用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定烟曲霉素残留量进行分析，该方面研究国内外未见报道。由于蜂蜜样品基质复杂，含有较高的糖类和蛋白质，因此本标准采用固相萃取技术对蜂蜜样品净化，电喷雾离子化，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测，外标法定量，烟曲霉素检出限为10.0 μg /kg。 四、方法概述 （1）选择了具有代表性的4种（洋槐蜂蜜、枣花蜂蜜、荆条蜂蜜和荞麦蜂蜜）常见蜂蜜基质进行研究，经过净化方法选择试验，液相色谱-串联质谱测定及确证条件试验，最终选择蜂蜜试样用水稀释，经HLB固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱（ESI+）检测，外标法定量。本方法科学合理、技术先进，既便于国际对等技术交流，又完全满足国外检测限量的需要。 （2）本方法经回收率试验，精密度试验，方法验证试验。结果表明，各项技术指标均完全满足检测需要。 五、实验技术论证 5.1.净化条件的选择 5.1.1 固相萃取柱的选择 实验了Oasis HLB（60 mg，3 mL）、Oasis HLB（200 mg，6 mL）、Oasis HLB（500 mg，6 mL）、Strata-X（200mg，6ml）和BAKERBOND SPETM C18 （500 mg，3 mL）的净化效果和回收率。实验表明，Oasis HLB（500 mg，6 mL）净化效果最好和回收率最高。因此，本方法选择这个固相萃取柱为净化柱。 5.1.2 淋洗液的选择 实验了在阴性蜂蜜样品中添加相同量的烟曲霉素标准，按相同方法，分别用浓度为10%、20%、30%、40%和50%甲醇水溶液作为淋洗液淋洗固相萃取柱，结果表明，30%甲醇水作为淋洗液淋洗，可以有效的去除杂质，消除基质