化妆品表面活性剂眼刺激性的角膜细胞试验.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 化妆品眼刺激性的角膜细胞试验 Corneal Cell line Testing for Cosmetics for Eye irritation 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2012年9月） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准依据GB/T 1.1-2009标准化工作导则进行编写。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：邱璐、李小林、王艳、钱平平、蒋静、刘俊平、程树军。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 化妆品眼刺激性的角膜细胞试验 范围 本标准适用于化妆品原料和成品眼刺激性体外筛选试验。 本标准适用于部分化妆品生产中使用的表面活性剂的筛选测试。 本标准可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一。可以结合其他眼刺激替代试验，对眼刺激效应进行综合评价。 本标准可作为其他领域样本眼刺激体外测试的参考方法。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2285-2009 化妆品体外替代试验实验室规范 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 眼刺激性 eye irritation 眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。 SIRC细胞系 statens seruminstitut rabbit cornea cell line 兔眼角膜细胞系 STE试验 short time exposure test 短时间暴露试验，本标准指5min暴露试验。 CCK-8细胞毒性测试法 cell counting kit-8 cytotoxicity test 直接使用的商品化检测试剂盒。检测原理与MTT (溴化噻唑蓝四氮唑，常用于细胞活力、细胞增殖或细胞毒性检测)法相同。其主要成分为WST-8，为类似于MTT的水溶性的四唑盐，甲臜WST-8对细胞毒性小，其生成的甲臜染料高度水溶性，甲臜Replacement）、减少（Reduction）、优化（Refinement）的原则，是以动物福利为宗旨的原则。 原理 在体外毒理替代试验中，细胞系是最为方便、易控的载体，除了可以满足替代试验的目标外，还可以实现高通量。眼刺激试验是化妆品重要的毒理检测项目，传统的眼刺激试验在实验兔眼上进行。SIRC细胞来源于动物试验的靶器官，采用STE的试验方式，克服了常规细胞毒性试验对样本溶解度的要求。根据溶解特性选择溶剂，在细胞上干预5min，然后将样本去除，最后通过与CCK-8染料反应，使活细胞染色，通过测定450nm的吸光度，计算细胞的生存率来判断样本的刺激性。这与其他在细胞系或组织上完成的测试试验一样，通常都是通过检测细胞的生存率（死亡率）为指标来判断不同类型的毒性。也可以通过与MTT染料反应，检测吸光度并计算生存率。 仪器与试剂耗材 仪器 II级生物安全柜 二氧化碳培养箱：温度37℃±1℃，湿度90%±5%，5%±1%CO2； 恒温水浴箱：温度37℃±1℃ 倒置显微镜 酶标仪：适合96孔培养板 电子天平 细胞计数仪或血球计数器 离心机 混悬仪 真空吸液泵 20μL，200μL量程排枪 试剂耗材 MEM细胞培养基：推荐使用进口品牌商品化成品 胎牛血清：56℃加热灭活30min 胰酶/EDTA（Trypsin/EDTA）：0.25% 青霉素/链霉素双抗：推荐购买100x商品化储备液，工作浓度青霉素（100U/mL），链霉 素（100ug/mL）。 二甲基亚砜（DMSO）：溶剂准备用 磷酸盐缓冲液（PBS）：溶剂准备用 矿物油：细胞培养级：溶剂准备用 CCK-8试剂（或MTT试剂）：推荐商品化购买 培养瓶及培养板：25 cm2和75 cm2培养瓶，用于常规培养；96孔平底细胞培养板，用于 干预试验。 试验方法 整个试验过程的规范操作按SN/T 2285-2009进行。 细胞来源 为保证溯源性，SIRC细胞最好由有资质的种子库提供。 SIRC完全培养基 MEM培养基，含10%胎牛血清，以及应用浓度青霉素/链霉素双抗。 细胞冻存与复苏 获得细胞后，每3-4day按1:3或1:4的比例扩大培养，在观察细胞生长状态较好的情况下，进行冻存。冻存液的配置为MEM完全培养基（含10%胎牛血清）+10%胎牛血清+10%DMSO。最初的冻存量应当较大，以此保证后面STE试验使用的细胞可以从