化妆品中绿脓杆菌的检测 焦磷酸测序法.docVIP

前 言 本部分依据GB/T1.1-2009要求起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出。 潍坊出入境检验检疫局。孙军、赵晗、张太翔、孙涛化妆品中绿脓杆菌检验方法 焦磷酸测序法范围 本标准规定了焦磷酸测序技术检测化妆品中的绿脓杆菌方法。 本标准适用于化妆品中绿脓杆菌的检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法（eqv ISO 3696:1987） GB 7918.1 化妆品微生物标准检验方法 总则 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 缩略语 本标准采用下列缩略语： PCR 聚合酶链式反应 DNA 脱氧核糖核酸 Taq酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 脱氧核苷三磷酸 ATP 三磷酸腺苷 原理 焦磷酸测序（Pyrosequencing）是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物（APS）、荧光素孵育，逐一加入四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP），如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号光信号由CCD收集并由软件转化为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 方法提要 利用基因组DNA纯化试剂盒提取绿脓杆菌基因组DNA；根据绿脓杆菌外毒素A基因序列的保守区域设计扩增引物和测序引物；利用扩增引物进行PCR筛选；阳性产物用于制备测序单链模板；利用测序引物测定目标序列，鉴定绿脓杆菌。 培养基和试剂 SCDLP液体培养基（见附录A.1）。 焦磷酸测序用引物序列 焦磷酸测序基因组DNA纯化试剂盒。 灭菌双蒸水。 Pyro Gold SQA Reagents 1×96 DNA 序列分析试剂盒或其他等效试剂。 仪器设备 恒温培养箱：36℃± 1℃。 PCR仪。 恒温水浴锅：30℃～60℃。 冷冻离心机：离心力12000 g。 可调移液器：5μL、10μL、100μL、1000μL。 焦磷酸测序仪。 天平：感量0.01 g80℃。 操作步骤 按照GB 7918.1方法制备1：10化妆品稀释液，取稀释液10 mL加到90 mL SCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养18~24 h。 注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。检验含有防腐剂的化妆品时，在每1000 mL普通肉汤中加入1 g卵磷脂、7 g吐温80。 从样品增菌液的表层取1 mL培养液加入到1.5 mL无菌离心管中，8000 r/min离心5 min，尽量弃去上清液，加入1 mL灭菌的双蒸水清洗1次后离心，同样尽量弃去上清液。按照DNA纯化试剂盒的步骤要求提取DNA。 的DNA-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。 μL，上下游扩增引物（20 μmol/L）各0.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）4 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，双蒸水补足体积至50 μL。 PCR反应条件94℃预变性5 min94℃变性30 s℃退火s，72℃延伸s，循环0次后72℃延伸10 min4℃保存反应产物。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。 PCR产物测序。在96孔板中每孔加入44 μL退火缓冲液，1 μL 20 pmol/μL测序引物，混匀。 链霉亲和素包被的磁珠混匀，3 μL转移到1.5 mL Eppendorf管中，加入μL结合缓冲液，使得每样达50 μL。 将50 μL PCR产物与50 μL磁珠混合，在室温25℃下孵育20 min。 用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，在70%乙醇中清洗5 s；变性缓冲液洗5 s；最后移到洗涤缓冲液中清洗10 s。 将真空吸附器放入8.4.1.1所述含有测序引物的96孔板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃ 烘箱2 min，然后冷却至室温。 测序反应 测序反应在28℃下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600 mbar/8 msec的加样压力和时间，每轮反应时间65。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的