绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的差异.DOCVIP

临床医学论文-绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的差异 【摘要】? 目的：探讨雌激素受体（ER）在绝经后退行性脊柱滑脱（DS）软骨终板内的表达及其意义。方法：用RTPCR方法检测绝经后DS与绝经前年轻女性正常腰椎(N)的软骨终板内ER mRNA的表达；Western blot方法检测绝经后DS与N的软骨终板内ER蛋白质的表达；用免疫组织化学法（Envision法）检测绝经后DS与N的软骨终板内ER的分布和表达，测定绝经后DS患者血液中雌激素浓度；分析雌激素、ER和DS之间的关系。结果：ER mRNA的表达量在绝经后DS的软骨终板中较N明显下降（P0.05）；绝经后DS的软骨终板中ER蛋白质的表达量较N明显下降（P0.05）；免疫组织化学结果显示ER在绝经后DS的软骨终板中仅少量表达，在N的软骨终板中表达量较强；绝经后DS患者血液中雌激素浓度明显下降。结论：女性在绝经后体内雌激素下降，软骨终板中ER表达量较N显著下调，可能是引起绝经后女性DS高发的原因之一。 【关键词】? 雌激素受体 退行性脊柱滑脱 软骨终板 ??? 脊柱不稳是指在脊柱结构丧失维持其自身生理平衡位置的能力，导致脊柱节段间位移超出其生理限度对于承载的异常反应。最常见的为退行性腰椎不稳，长期的不稳逐渐发展为退行性脊柱滑脱（degenerative spondylolishesis DS）。DS是一种独特形式的椎体滑脱，为神经孔完整的进展性椎体滑移[1]。然而，DS的病因还不清楚。在过去几十年中，大多数研究仅强调了关节突关节形态的异常[23]，但Love等[4]指出小关节角度的增加是小关节炎重建的结果，而不是DS的起始病因。 ??? DS多见于女性，在40岁以前一般不发病，绝经后发病率显著升高。这表明雌激素在DS发病中可能有潜在作用。Richmond等[5]发现成人软骨细胞中有雌激素受体（ER）α、ERβ的mRNA表达和ER蛋白的存在，说明软骨是雌激素敏感性组织。女性绝经后体内雌激素水平下降，下调ER的表达，可能是绝经后妇女高发DS的原因之一。 ??? 本研究对成年女性软骨终板上ER进行检测,比较绝经前后软骨终板上ER的表达情况，旨在阐明雌激素及其受体在DS中的可能作用。 ??? 1?? 材料与方法 ??? 1.1? 标本来源 ??? 取2006年4月 2006年8月期间东南大学附属中大医院骨科因DS行椎间植骨融合椎弓根钉内固定术的绝经后患者共18例，术中用刮勺刮取软骨终板（不包括骨性终板和软骨下骨）作为实验组，同期本校解剖教研室取新鲜女性尸体软骨终板18例作为对照组。所有标本保存于-80 ℃待提取RNA及蛋白质。记录患者和尸体的体重、年龄和体重指数。以人群绝经前妇女血液中平均雌激素浓度作为对照组，测患者术前清晨空腹血液中雌激素浓度作为实验组。 ??? 1.2? 主要试剂 ??? 兔抗人ERβ抗体（Abcam公司，英国），羊抗兔第二抗体（南京大治生物有限公司），显色试剂DAB（北京中杉生物有限公司）。TRNzol总RNA提取试剂盒（Takara公司），通用两步法RTPCR试剂盒（北京博大泰克生物基因技术有限责任公司）。 ??? 1.3? 实验方法 ??? 1.3.1? RTPCR?? （1）细胞总RNA的提取：用微量天平称取100 mg组织，液氮冷冻，在研钵中不断加入液氮的情况下研磨成粉末状，转入2 ml玻璃匀浆管在冰浴下制成组织匀浆，加入2 ml TRNzol试剂。按试剂说明书提取细胞内的总RNA，紫外分光光度仪（UV755B型，上海精密科学仪器有限公司）测定其浓度和纯度，重复3次，计算样本总RNA浓度，A260/A280值在1.8 2.0之间。（2）RNA完整性的鉴定：溴化乙锭凝胶电泳，显示28 S、18 S及5 S 3条带，且28 S/18 S为2/1。（3）引物的设计与合成：在GenBank查到人类ERβ和βactin（内参）的编码序列及合成引物序列。ERβ扩增产物的长度为888 bp，上游引物为5′AAGAGCTGC CAGGCCTGC3′，下游引物为5′CATCTCCAGCAGCA GGTCA3′；βactin扩增产物长度为621 bp，上游引物为5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3′，下游引物为5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′。（4）RTPCR及凝胶成像分析：按照两步法RTPCR试剂盒说明书分别进行反转录和PCR扩增，PCR的反应条件为变性94 ℃ 1 min,退火55 ℃? 1 min,延伸70 ℃ 1 min,共35个循环,最后1个循环72 ℃延伸7 min。取5? μl的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，应用image MASTER凝胶成像仪照相，而后