小麦细胞操作与基因工程体研究.pdf

摘 要 小麦 Triticum aestivumL.是世界上第一大粮食作物 是我国仅次于水稻 的第二大粮食作物 其籽粒中含有65-70%的淀粉 7-22%的蛋白质 2-4%的脂肪 同 时还有钾 磷 镁 铁 氟等多种矿质元素和维生素B 因此对小麦的育种研究 特 别是以基因工程为重点的品质改良研究 一直是基础生物学和应用研究中最重要的 课题之一 本文应用现代组织培养技术和现代分子生物学技术 对 6个小麦主栽品 种的组织培养条件进行了系统研究 对100个株系的1Dx5基因转基因小麦的后代遗 传特性及表达规律进行了系统分析 研究工作的主要内容和结论如下 1. 优化了小麦组织培养条件 建立了以小麦幼穗切段 幼胚盾片和成熟胚盾片 为外植体的高效稳定再生体系 基因型 对6个基因型的共4430个材料个体的组 织培养结果表明 总体植株平均再生频率为 17.2%鄂麦 12的再生频率要显著高于 其它品种 平均为22.0%单个组合中最高平均可以达到83% 外植体 幼穗 幼 胚和成熟胚的平均植株再生频率分别为29.6% 30.1%和5.0%优化后分别为46.7% 63.3%和 13.3%单个组合中最高分别可达60.0%83.0%和30.0%各组培外植体植 株再生能力顺序为 幼胚 幼穗成熟胚 激素 2,4-D与Picloram诱导愈伤组织 的总体植株再生频率分别为27.6%和 18.2%分化培养基中含 0.01mg/l和 0.1mg/l 2,4-D的植株总体再生频率分别为23.5%和 11.9%幼穗 幼胚和成熟胚诱导培养基 中分别含 4.5mg/l 2,4-D 0.5mg/l 2,4-D和 1mg/l Picloram分化培养基中均含 0.01mg/l 2,4-D为优化后的激素条件 继代 愈伤组织继代对植株的再生频率没 有显著的影响 洗涤剂 稀释到10.0%的家用白猫洗洁精 GB9985和升汞消毒处 理后的植株总体再生频率分别为 22.1%和 25.8%组织培养的污染率分别仅为 8.3% 和 0.0%再生分化指标间的相关分析表明 绿点分化和每团愈伤组织出苗数相互 独立 根的分化与植株再生存在显著负相关 但与绿点分化具极显著正相关 每团 愈伤组织出苗数与植株再生具极显著正相关 2. 分析了外源 1Dx5 基因的表达规律 转基因材料的栽培试验 对 140个单 I 株的栽培实验验证了温度和水分对小麦生长的影响 以y x1 x2 x3 和x4 分别表示 穗长 株高 节数 顶节长和剑叶长 分析得到y= 1.413+0.050x +0.149x -0.867x -0.024x- 1 2 3 4 生长特征方程式 温室中各个基因型的植株成活率 分蘖数 株高 节数 顶节长 穗长 剑叶长和种子数的总体平均都大于网室中生长结果 叶片 DNA提取方法的 优化 对117个单株的DNA提取量平均为116ng最高为250ng选取7cm长三叶期 幼嫩叶片 DNA提取过程中温浴30分钟 离心7分钟为优化的条件 PCR和SDS 分析 对102个样品材料的PCR结果是对照都没有1Dx5基因片段的存在 转基因株 系48个B72-8-11b的单株中有26个有1Dx5基因 B73-6-1的52个单株全部检测到 1Dx5基因的存在 SDS技术检测到有 1Dx5基因的78个单株均有 1Dx5蛋白的 表达 超表达率达59.0%低表达率仅为7.7%来源于同一单株的转基因种子 1Dx5 基因的表达都达稳定状态 不存在表达差异 转基因后代外源基因的传递及规律完 全遵循孟得尔遗传分离规律 并均属纯合系 关键词 小麦 幼穗 幼胚 成熟胚 组织培养 遗传转化 后代分析 PCR SDS纯合系 超表达 II ABSTRACT Wheat Triticum aestivum L. i