IL18PE38重组免疫毒素及其治疗实验性变态反应性脑脊髓炎研究.pdf

四P1大学博士学位伦文 MBP myelinbasicprotein 髓鞘碱性蛋白 MCS muticlonesite 多克隆位点 Mr relativemolecularweight 相对分子量 M T methylthiazolyltetrazolium 四氮甲基哇蓝 M S mutiplesclerosis 多发性硬化 P C I polymerasechainreaction 聚合酶链式反应 P E pseudomonasexotoxin 绿脓杆菌外毒素 A R rheumatoidarthritis 类风湿关节炎 SDS sodiumdodecylsulfate 十二烷基磺酸钠 Thelpercell T辅助细胞 VEGF vascularendothelialgrowth 血管内皮生长因子 伪ctor 四川大李博士李位枪次 IL-18-PE38重组免疫毒素及其治疗实验性 变态反应性脑脊髓炎的研究* 博 士 生 李 虹 导 师 张 林 教授 中 文 摘 要 目 的: 自身免疫性疾病是目前公认的一类难治性人类重大疾病，严重威胁人 类健康。实验性变态反应性脑脊髓炎 (experimentalallergic encephalomyelitis,EAE)由于与人的多发性硬化病 (MS)和急性脑脊髓 炎在临床表现、生化指标及病理等方面具有相同特征性，因而一直是研究 神经系统自身免疫性疾病的良好模型，也是Thl细胞介导的器官特异性 自身免疫性疾病的典型代表。目前这类疾病的治疗措施主要是长期采用各 种非特异的免疫抑制剂，往往会使患者免疫系统受到普遍性抑制而导致严 重的感染和肿瘤发生等。因而有关自身免疫性疾病的特异性免疫治疗一直 是人们密切关注、有望成为一个突破口的研究热点。在近年基础免疫学研 究进展的启发下，本课题选择新近发现的活化T细胞的表面标记IL-18 受体 I〔L-18R)为靶点，构建重组免疫毒素IL-18-PE38的表达质粒，并 通过基因治疗技术将其接种于EAE模型鼠体内，观察实验动物EAE症状 及体征的改善情况以及相关细胞因子的动态变化来评价其治疗效果，并探 讨其抗自身免疫性疾病的作用机理。 方 法: (1)采用RT-PCR法从小鼠肝总RNA中扩增mIL-18目的基因片段， 四川大学博士李位讼久 将其连接到含 PE38的原核表达载体上，构建成重组质粒 PRKL-IL18-PE38，经酶切鉴定及测序确认后，转化大肠杆菌BL21，通过 Western-blot测定重组蛋白的表达。 (2)将mIL-18与PE38融合基因定向克隆入真核表达载体 pSecTag2B，构建重组质粒pSecTag2B-IL18-PE38。经鉴定确认后，用脂 质体包裹纯化的重组表达质粒，体外转染NIH3T3细胞株，通过免疫荧光 法检测重组蛋白的表达，并利用转染后细胞培养上清体外测定IL-18-PE38 目的蛋白的生物活性。 (3)首先通过免疫方法的调整与改进，建立非敏感品系C57BL16小 鼠的EAE模型，再利用基因治疗的方法分别将pSecTag2B-IL18-PE38裸 质粒及纳米脂质体包裹