重组创伤弧菌溶细胞素对人Jurkat T淋巴细胞损伤机制初探.pdf

吣4 iiiii■■I 吣7 洲Y iii●l 帆7， m4洲5 温州医学院硕士论文 目录 中文摘要………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………4 前 言 ………………………………………………………………7 第一部分 材料与方法…………………………………………………………9 结 果 …………………………………………………………19 分析讨论……………………………………………………………23 第二部分 材料与方法…………………………………………………………26 结 果 …………………………………………………………32 分析讨论……………………………………………………………41 第三部分 材料与方法…………………………………………………………43 结 果 …………………………………………………………48 分析讨论……………………………………………………………56 ，J、结 …………………………………………………………………58 参考文献………………………………………………………………59 附录…………………………………………………………………62 温州医学院硕士论文 T淋巴细胞损伤机制初探 重组创伤弧菌溶细胞素对人Jurkat 中文摘要 目的： T淋巴细胞凋亡的作用及细胞 l、研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人Jurkat 凋亡过程中caspase．3，．8，．9活性变化。 2、研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导人JurkatT淋巴细胞凋亡过程中胞内 活性氧的变化及与rVvhA诱导的细胞凋亡的关系。 T淋 巴细胞损伤中的作用。 4、为进一步了解和明确创伤弧菌溶细胞素的分子致病机制研究提供科学依据。 方法： l、rVvhA融合蛋白的表达、纯化和复性将课题组先前已构建好的含 BL21(DE3)工程茵，IPTG诱导其表达， pET28a(+)-whA表达质粒的E．coli SDS．PAGE分析表达产物。其中以包涵体形式表达的蛋白质，用洗涤液I、II和 blot 进行分析鉴定，rVvhA活性蛋白的活性用兔红细胞溶血实验进行分析。 2、rVvhA活性蛋白诱导人JurkatT淋巴细胞凋亡分子机制初步研究将rVvhA活 胞毒性作用；采用光镜观察、Hochest33258荧光染色、AnnexinV／PI双染流式细 T淋巴细胞凋亡；采用分光光度法检测 胞仪检测rVvhA活性蛋白诱导的Jurkat rVvhA活性蛋白作用Jurkat 性的变化；Westemblot免疫印迹实验检测rVvhA活性蛋白作用上述细胞后， T淋 Caspase．3的表达和活化情况。初步掌握和了解，rVvhA活性蛋白对Jurkat 巴细胞的细胞毒作用。 复性纯化的rVvhA活性蛋白作用于人JurkatT淋巴细胞，观察细胞的损伤情况， 温州医学院硕士论文 利用DCHF．DA荧光探针，检测其胞内ROS