RNA干扰抑制Pin1基因对大肠癌SW620细胞增殖及凋亡能力的影响.pdfVIP

RNA 干扰抑制 Pin1 基因对大肠癌 SW620 细胞增殖及凋亡能力的 影响 中文摘要 研究背景： 大肠癌(colorectal carcinoma)是严重威胁人类生存的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率 在西方国家居恶性肿瘤的第 2 位，在我国居第 4 位。经临床研究发现，大肠癌的 5 年存 活率较低。因此,早期发现、诊断与治疗是提高大肠癌患者生存率的关键。但由于传统治 疗方法的特异性、敏感性差，致使治疗效果欠佳。近年来，随着分子生物学技术的快速发 展，大肠癌发生发展的分子机制也取得了突破性研究。而临床研究表明，细胞的增殖是导 致肿瘤发展的重要原因，因此研究大肠癌增殖和凋亡的分子机制显得尤为重要。 Pin 1,肽基脯氨酰异构酶 (peptidy-prolyl cis/trans isomerase PPIase) 是多肽脯氨酰基顺 反异构酶（PPIase ）家族成员之一，是一种高度保守、特异的顺反异构酶，可特异性地绑 定到磷酸化的脯氨酰前的丝氨酸或苏氨酸位点 (Ser/Thr-Pro 基序)，催化其发生顺反异构， 进而调控底物蛋白的功能、蛋白与蛋白之间的作用，以及亚细胞的定位。研究表明 Pin1 在 人类多种恶性肿瘤中呈高表达状态，与肿瘤的增殖、血管形成、侵袭和转移有关，因此被 称为肿瘤发生、发展的催化分子。进一步研究发现，Pin1 在结直肠癌中也呈现过表达，并 与结直肠癌的恶性程度明显相关。本研究应用 RNA 干扰技术进一步探讨 Pin1 对结肠癌 SW620 细胞的增殖、凋亡能力影响及作用机制。 目的： 1. 构建 Pin1 基因的RNA干扰表达载体(pGenesil-1-Pin1 ，缩写 P-shRNA)。 2. 观察pGenesil-1-Pin1对大肠癌 SW620 细胞中 Pin1 基因表达的抑制作用。 3. 探讨 Pin1 基因表达下降后对大肠癌 SW620 细胞增殖、凋亡能力的影响，以及相关基 因的表达改变情况，并初步分析其可能的分子机制。 方法： 1. 构建 Pin1 基因有短发夹结构的干扰表达载体 pGenesil-1-Pin 1 （缩写P-shRNA ）、对照 载体 pGenesil-1-CON (简写p-CON)，经双酶切后，琼脂糖凝胶电泳及 DNA 测序进行 鉴定。 2. 利用脂质体将重组质粒 p-shRNA 和 p-CON 分别转染入人大肠癌细胞株 SW620，提 取总蛋白质，应用 Western blot 实验技术检测其对Pin1基因蛋白表达水平的影响。 3. 细胞培养计数，绘制生长曲线，利用 MTT 实验检测 SW620 细胞转染 p-shRNA 质粒、 p-CON 质粒后的增殖能力，采用流式细胞术检测 SW620 细胞转染后的凋亡情况。 4. 利用细胞免疫 荧光方法检测 SW620 细胞转染 p-shRNA 质粒 、p-CON 质粒后 NF-κB/p65 的核定位。Western blot 技术进一步检测 NF-κB/p65 的核转移的量，以及 I 凋亡相关因子 Bcl-2 的表达。 结果： 1. 成功构建Pin1基因的RNA干扰表达载体;经双酶切、琼脂糖凝胶及DNA测序鉴定正确。 2. 利用脂质体介导重组质粒转染 SW620 细胞后 ，可以抑制Pin1 蛋白质的表达。 p-shRNA/SW620 组 Pin1 蛋白 的相对表达量为 0.065±0.005 ，p-CON/SW620 组为 0.34±0.027 ，其 48h 抑制率约为79.3% ；统计分析表明，组间差异有统计学意义 （P0.05 ）。提示转染 Pin1 干扰质粒可以有效地抑制 SW620 细胞中 Pin 1 基因的表 达。 3. 生长曲线、MTT 法、流式细胞术、实验结果表明 :转染 Pin1 干扰质粒后 SW620 细 胞增殖能力