贝类中诺如病毒(norovirus)检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR检测.doc

前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准替代SN/T 1635-2005《贝类中诺沃克病毒检测方法-普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》 本标准与SN/T 1635-2005相比，主要修改如下： ——修改了标准的中文名称； ——修改了病毒名称，即由诺沃克病毒修改为诺如病毒。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘军义、潘良文、张舒亚、李晓虹、韦梅良、罗兆飞。 贝类中诺如病毒检测方法-普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法 范围 本标准规定了贝类中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于贝类中诺如病毒的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。　　GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 Ct值 Cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 试剂 所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。 诺如病毒阳性标本：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。-80℃低温冰箱保存。 甘氨酸缓冲液: 见附录A.1.1。 PEG 8000溶液: 见附录A.1.2。 裂解液：Tri-reagent（Sigma公司， Cat.No.T-9424）Poly（dT）磁珠：Dynabeads-oligo（dT）25（Cat. No.61005，Dynal Biotech Inc.，Oslo，Norway）或等效品。 无RNase超纯水：见附录A.2.3。 75%乙醇：见附录A.2.4。 异丙醇：未开封的新品。 1×RNA吸附缓冲液：见附录A.2.5。 2×RNA吸附缓冲液：见附录A.2.6。 洗液：见附录A.2.7。 RNase抑制剂。 逆转录酶 AMV。 DNA聚合酶。 dNTPS：含dATP、dUTP、dCTP、dGTP各10mmol/L。 引物和探针：根据表1和表2的序列进行合成引物和探针，加无RNase超纯水配制成50μmol/L储存液。 DNA 分子量标记：100bp-2000bp。 50×TAE缓冲液：见附录A.1.3。 溴化乙锭溶液(10 μg/μL)：见附录A.1.4。 含0.5 μg/mL溴化乙锭的1.5% 琼脂糖凝胶：见附录A.1.5。 10×加样缓冲液：见附录A.1.6。 普通RT-PCR检测的引物 检测的病毒类群 引物 扩增片断大小（bp） GI和GII 正义引物JV12：5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’ 反义引物 JV13：5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’ 326 实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 检测的病毒类群 引物和探针序列 扩增片段大小（bp） GI 正义引物 COG1F：5’-CGYTGGATGCGNTTYCATGA-3’ 反义引物 COG1R：5’-CTTAGACGCCATCATCATTYAC-3’ 探针RING1(a)-TP：5’-FAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-TAMRA-3’ 探针 RING1(b)-TP：5’-FAM-AGATCGCGGTCTCCTGTCCA-TAMRA-3’ 107 GII 正义引物 COG2F：5’-CARGARBCNATGTTYGRTGGATGAG-3’ 反义引物 COG2R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’ 探针 RING2-TP：5’-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRA-3’ 119 仪器与器材 实时荧光PCR仪。 PCR仪。 电泳仪。 凝胶分析成像系统。 冷冻离心机。 匀浆器。 水浴锅。 微量可调移液器移液器μL, 200μL, 1000μL)、无RNase药匙、无RNase PCR薄壁管’末端含有一个Poly (A)的结构，用含有Poly(dT)的磁珠吸附诺如病毒RNA进行进一步纯化。利用普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行检测，对可疑的PCR产物进行测序分析确证。 检测步骤 病毒的富集 解剖取下贝类的中肠腺组织。 取5g中肠腺组织加入35mL甘氨酸缓冲液（pH 9.5）。 匀浆器高速匀浆3min，将匀浆液装