PPARs筛选模型构建及抗糖尿病天然药物活性成分筛选.pdfVIP

The Construction of PPARs Screening Model and the Screening of Active Ingredients from Natural Medicines with Potential Antidiabetic Properties A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Doctor’s Degree of Engineering By Lin Yexin Supervised by Prof. Xia Zhining and Prof. Christensen Lars Porskjær Specialty：Biopharmaceutical Engineering College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China April 2013 中文摘要 摘 要 过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptor ， PPAR ）与糖尿病等代谢疾病在内的慢性疾病密切相关。现有的PPARs 激动剂包括 天然激动剂和合成激动剂。由于人工合成的激动剂，尤其是单靶点的PPARγ 配体 药物，不断显现出严重的毒副作用，现急需寻找低毒、高效的PPARs 泛激动剂。 而天然药物尤其是中药，多年来都发挥着治疗和预防疾病的重要作用，且具有可 长期服用的特点，使得从天然药物中筛选新型的PPARs 泛激动剂，成为开发治疗 糖尿病及其相关并发症药物的研究热点。 本研究以PPARα, PPARβ 和PPARγ 作为靶点，首次从12 种具有治疗糖尿病作 用的天然药物中，筛选出了PPARs 活性部位及成分，是对其药物作用机理的补充 和阐明，为这些天然药物的现代化发展，及糖尿病新药的研制奠定了基础。 首先，为能有效的从天然药物中筛选出PPARs 激动剂，在细胞水平上建立了 以PPARα, PPARβ 或PPARγ 为靶点的高通量筛选模型。将重组质粒pBIND-PPAR （α、β 或γ ）-LBD 与报告基因pGL4.35 ，共同转入HeLa 细胞中，以PPARs 的激 动剂作为阳性对照（PPARα ：非诺贝特；PPARβ ：L165041 ；PPARγ ：罗格列酮）， 通过测定荧光酶素的表达率，确定了PPARs 筛选实验的条件。同时，首次引入Z′- 因子对以 PPARα, PPARβ 或 PPARγ 为靶点的细胞模型进行评价。证实本研究在 HeLa 细胞上，构建了一种简单、稳定、有效的和多靶点的高通量筛选模型，可用 于筛选PPARs 泛激动剂、双激动剂或单激动剂。 接着，制备天然药物的提取物。用不同极性的溶剂，正己烷、70% 乙醇、乙酸 乙酯和蒸馏水为溶剂，依次对12 种具有治疗糖尿病作用的天然药物（川黄连、女 贞子、猪牙皂、广西山楂、石斛、桑叶、丹参、泽泻、林檎叶、绿萝花、翼首草 和灰兜巴）进行全成分提取，最终获得58 个提取物。 为明确这 12 种天然药物的PPARs 活性部位，用构建好的PPARs 高通量筛选 模型，对58 个提取物先开展了PPARγ 和PPARβ 的活性筛选试验。证实12 种药物 的提取物中，只有泽泻对PPARγ 或PPARβ 均无激活作用；而58 个提取物中共有 26 个提取物对PPARγ 和PPARβ 同时具有激活作用。其中有3 个提取物，即绿萝 花的乙酸乙酯萃取物（EB1 ）和正己烷提取物（EA ）、翼首草的 EA，在测试的浓 度范围内，对PPARγ 和PPARβ 的最