单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA).pptVIP

12. 添加 OPD 底物 12.1. 按照试剂说明书准备 OPD 溶液. 12.2. 每孔加100uL OPD 溶液 12.3. 20oC避光孵育足够长时间. 13. 加酸终止底物发光反应. 13.1. 每孔加 100uL 0.5M H2SO4. 14. 读板 14.1. 490nm处读微孔板. 14.2. 记录所读 OD 值，根据阴阳对照判断结果。 MAIPA ELISA Plate 原始MAIPA和改进MAIPA的比较 MAIPA 20 Years Substrate Colour Kiefel et al, Blood 1987 Anti-Mouse E Anti-Human Glycoprotein Mab Platelet Antibody Trimolecular Complex mab human ab lyse MAIPA步骤示意图 Kiefel et al, Blood 1987 1. Stage 2. Stage Platelets ab wash wash ab mab lyse immune complex E E Substrates Color wash wash GAM GAH* 1x 3x 5x 5x 糖蛋白的鼠源单克隆抗体 Platelet Glycoprotein CD Mab Clone Platelet Antigens GP IIb/IIIa 41, 61 Y2/51, P2 HPA- 1, 3, 4, 6, low incidence, platelet autos GP Ib/IX 42a, 42b SZ1, SZ2 HPA-2, platelet autos GP Ia/IIa 49b Gi9 HPA-5 CD109 CD109 Tea/16 HPA-15 (Gov) HLA Class I HLA ABC W6/32, B9.12.1 HLA Class I (ABC) MAIPA的优点和缺点 ?? highly specific wide spectrum of GPs robust objective standardized accepted ?? anti-mouse need of platelets need of mabs need washing steps time consuming experienced technologist * 张可莹 单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA) 血小板抗原 人类血小板抗原(HPA)是一组复杂的不均一的膜蛋白系统,由于感染或免疫因素引起的血小板抗体与临床输血和疾病诊断关系密切。 近年来,随着检验医学的发展和检测技术的不断更新,对血小板抗体的本质和靶抗原的研究日益深入, HPA的生化特性及其遗传学多态性逐渐被揭示。 血小板血型的研究从血清学方法发展到分子免疫学方法,为血小板抗体的检测及其膜糖蛋白分析提供了新的检验技术,对研究手段的完善以及疾病的诊断具有重要的临床意义。 如何提高血小板抗体检测技术将成为输血与检验医学今后的研究重点。 血小板血型抗原系统 人类血小板表面具有复杂的血型抗原：自身抗原和和同种抗原 自1959年第一个HPA被鉴定以来,至今已检出24个HPA,被归纳为13 个HPA 系统(HPA1-13 ) ,其中HPA1-5的临床意义较大。 2003年由国际输血协会( ISBT)和国际血栓和止血协会( ISTH)联合成立的血小板命名委员会( PNC) ,对HPA进行了系统命名,建立了命名原则和认可新抗原的标准。 目前已有22个HPA被正式命名,相应基因遗传多态性的分子基础也被阐明。这些抗原系统的共同特点是:常染色体显性遗传,多数已证实由共显性双等位基因控制,在cDNA序列中有1～2个碱基的差别, 导致翻译时1个氨基酸的突变。 血小板表面存在着特异性抗原和非特异性抗原,其中HPA1-5抗原系统包含10多个抗原,由血小板特有的抗原决定簇组成,是血小板本身特有的抗原,表现出血小板独特的遗传多态性。 近年发现某些血小板特有的抗原也存在于其他细胞或组织上,这些抗原多表现在细胞黏附分子超家族和整连蛋白上。 主要有3种类型的血小板膜糖蛋白( GP) 携带HPA 分子: 1 .富含亮氨酸糖蛋白带有HPA-2和HPA-12bw抗原; 2. CD109蛋白携带HPA-15抗原; 3 .其他的HPA均位于整连蛋白上。 整连蛋白是一个质膜糖蛋白家族,为受体蛋白,他们涉及到细胞-间质和细胞-细胞间的黏附