bFGF对CNE-I鼻咽癌细胞蛋白激酶B和c-fos的影响.pdfVIP

中文摘要 埽铲—春 蛋白激酶B(PKB)是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，它与蛋白激酶 to A和蛋白激酶C具有相似的氨基酸序列，所以又叫RAC(related AandCKinase)强白激酶。目前在人体内已克隆出PKB三种亚 PKB，、／主要在脑、心脏和肾脏中表达。自从1995年发现PKB是磷 脂酰肌醇3一激酶(P13-K)的直接下游靶物以来，PKB就成为信号 转导深入研究的焦点。 f PKB在蛋白质和脂类合成、葡萄糖代谢与运输、细胞周期演 迸莉基因调控、抑制细胞凋亡、促进血管形成和肿瘤转化等方面发 挥重要的作用。PKB处于多个信号转导通路的交叉点，成为生长 因子介导的P13-K信号转导通路中的重要组成因子。肿瘤细胞自 身可以分泌大量的生长因子，它们通过自分泌或旁分泌方式与细 胞表面的生长因子受体结合，激活一系列信号转导途径，从而促进 细胞增殖。因此，研究生长因子介导的信号转导途径具有一定的 临床应用价值。现已发现许多生长因子如EGF、PDGF、VEGF、IGF 一1和bFGF等能与酪氨酸蛋白激酶受体结合，激活P13一K，产生 转位至细胞膜处，在磷脂酰肌醇依赖激酶l(PDKl)和磷脂酰肌醇 化，活化的PKB再转位至细胞核内(目前机制尚不清楚)，参与核 内相关基因的转录，而且活化的PKB通过磷酸化BAD和激活胱 冬肽酶easpase一9又可发挥抗凋亡的活性。‘、厂 关于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)通过P13一K／PKB信号 途径调控鼻咽癌细胞增殖的具体机制仍不清楚。本文通过改变 bFGF作用于CNE-I鼻咽癌细胞的时间，检测细胞浆和细胞膜 PKB活性和即早基因c·fos的表达情况，进一步研究bFGF通过 PB—K／PKB通路调控鼻咽癌细胞生长的信号转导机制。因此，我 们设想通过阻断PB．K／PKB信号转导通路抑制肿瘤细胞生长，诱 导肿瘤细胞凋亡，这为治疗肿瘤提供了新思路。 一 ／实验材料与方法 、＼3 1．实验材料 1．1实验对象 CNE—I鼻咽癌细胞系，由本实验室传代培养。 1．2试剂 RPMI 1640培养基为GibcolBRL公司产品；组蛋白2B购自 品，进口分装)购自福州迈新生物公司；辣根过氧化物酶标记的山 羊抗兔IgG为／h-omega公司产品；辣根过氧化物酶发光试剂盒购 自北京中山生物技术公司；bFGF购自北京双鹭药业有限公司；[7 —32P]ATP购自北京亚辉生物工程公司；EGTA和二硫苏糖醇 (DTF)购自华美公司；其它试剂为国产分析纯。 1．3仪器 二氧化碳培养箱(日本HITECIT一41型)，超净工作台(苏州 ST一70)，超声 净化设备厂)，紫外灯，高、低速离心机(美国Sorvall 波细胞粉碎仪UP (上海医疗仪器公司)，电泳槽(北京六一仪器厂)，DY一Ⅲ型电转 移槽(北京六一仪器厂)。 2．实验方法 ·2· 2．1细胞培养：CNE—I细胞以含有10％小牛血清的RPMI 1640培养基于370C、5％C02的培养箱培养。 2．2 细胞处理及分组：选择生长状态良好的细胞，无血清饥 饿18h，然后在无血清培养基中加人bFGF孵育，按下述分组进行 处理。随机分组做bFGF作用的时间曲线，bFGF作用时间分别为 的终浓度为50ng／ml。 2．3活性测定：同位素标记法检测酶活性。 Blot。 2．4检测即早基因c—fos的表达：Western 2．5蛋白含量测定：考马斯亮蓝结合法(BradfordAssay)。 J1．26。 11．0，Image 2．6统计学分析：SPsS