针对点突变癌基因转录物的核酶细胞内性质的研究.pdfVIP

遗传HEREDITAS(Beijing)18(6):27 281996 小鼠卵母细胞减数分裂染色体的制备 李朝军 袁来平① 张锡然 陈宜峰 南《京师范大学生物系，南京 210097) PreparationofMeioticKarytypeofMouseOocyte LiChaojun YanLciping ZhangXiran ChcnYifeng (BiologyDepartmentofNanjingNormalUniversity,Nanjing210097) 哺乳动物的卵母细胞的减数分裂过程中存在两次自发的停滞现象，第一次是在第一次减数分裂前期的双线 期，这一静止期持续很长时间，一直到动物性成熟后卵母细胞进人发育周期，在促性腺激家的作用下，卵母细胞 的第一次减数分裂才重新启动．完成第一次减数分裂后，又停滞在第二次减数分裂的中期．在精子或化学因素刺 激的作用下，完成第二次减数分裂(4)．因此，对pill乳动物的卵母细胞在一定条件下进行培养，可制备减数分裂 过程中各时期染色休的标本，尤其是两次减数分裂中期染色休的制备尤为方便．并通过显示C带进一步确定染 色休的数目，可用于研究休外培养条件下各种因家对卵母细胞染色休的影响． I材 料 与 方 法 1.1卵母细胞的获取和体外培养 取 19-22日龄的雌性昆明系小鼠，用51U／只孕马血清激索处理以促进卵泡发育．48小时后，颈部脱位法 处死小鼠．将卵巢置于M2培养液中，在实休解剖镜下除去输卵管及附着的脂肪，用小号针头穿刺有腔卵泡，轻 轻挤压，外面包围有卵丘细胞生长完全的卵母细胞从卵泡中逸出．用玻璃吸卵管将卵母细胞一一移出，置于M2 培养液中，用略小于卵母细胞直径的吸卵管轻轻吹打卵毋细胞。将外而的卵丘细胞去除．将卵母细胞置于覆盖有 石蜡油的微滴中，于37r-,5%CO：的溉度饱和培养箱中培养，培养液为DMEM+4mg/ml牛血清白蛋白． 1.2中期I和中期II染色体的制备 培养 18-20小时后，卵母细胞自发停滞于第二次减数分裂的中期．用链蛋白酶E处理去除透明带，将第一 极体去除．以避免极休内染色体的干扰．若要得到第一次减数分裂中期相，可在培养液中加0.2pg/ml秋水仙素 使卵母细胞停止在第一次减数分裂的中期． 制备中期I染色体时，卵母细胞可在双蒸水中低渗处理30-40分钟去（除透明带的中期II卵母细胞可在1% 的柠檬酸钠中低渗）．用吸卵管吸取低渗较好的卵毋细胞于干净载玻片上，当溶液快干前，在解剖镜下将3:1的 甲醇：冰醋酸滴人固定，固定几次后更换为1：1III醇 ：冰醋酸．空气干燥后，Gicmsa(1：9)染液扣染30分钟， 自来水冲洗数秒．晾干后观察． 1.3染色体C带的制备 取片龄在 I周左右的染色休玻片标本，3:1的甲醉 ：冰醋酸固定液褪色1分钟．在0.2mol/L盐酸溶液中 室温处理30分钟，除去非酸性蛋白质．蒸馏水清洗后，于52℃的5％的Ba(OH)：水浴中处理6分钟到8分钟左 右，于60℃的2xSSC榕液中处理2小时，清恍后用3％的Giemsa染液染色15分钟，观察 (I)． ①引级木科生，现工作单位：江苏省如皋市搬经中学． 28 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1996 18卷 2结 果 一与 讨 论 国内有关哺乳动物减数分裂染色体的研究，大多集中在雄性动物 (2（)，可能是因为雌性动物的染色体制备相 对困难的缘故．本研究的目的就在于建}L一个相对简单易行的卵.rI;:细胞减数分裂染色体的制各方法r实验结果如 图1所示，图la为MI晚期的分裂相．表现出20对同源染色休相互配对的现象．由于小鼠是端着丝粒染色体， 因而1E在分离的十字形的同源染色体配对特别清晰．图lb为ME分裂相。表现为姊妹染色单体尚未分离前的20 个姊妹染色体的形态．图lc为第一次减数分裂早中期分裂相的C带图，可见尚存在交叉的终变期染色体和正在 分离的同禅染色体．每对同源染色体均有两个若丝粒，着丝粒的个数为40. 制备卵母细胞染色体时，有采用在小离心管低渗、固定 ’（〕，或在表而皿里低渗、固定方法 )5〔，其目的都 是防止卵母细胞的丢失，我们在试验发现，山于卵母细胞本身的粘附作用和不同溶剂相的扰动，这些方法还是容 易造成细胞的丢失，所以我们采用低