黄曲霉毒素解毒酶体外定向分子进化及结构分析的研究.pdfVIP

黄曲霉毒素解毒酶体外定向分子进化及 结构分析的研究(I)· 张赛邢克克胡亚冬温思霞谢春芳姚冬生弗 暨南大学微生物技术研究所，510632拳通讯作者，tdsyaoSjnu．edu．cn tabescens 本研究所己从一株ArmillariellaE-20菌株分离得到一种能够 ADTZ)，研究已经表明：黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)，是一种具有氧化还原作用的 解甚少，虽然在ADTZ结构与功能的生物学预测方面可获取一些信息，但是却难以 解释其实际的功能。该基因全长cDNA已被克隆，并已实现其在毕赤酵母表达系统 中的分泌表达。本研究用非理性设计——定向分子进化技术，对酶进行体外分子 改造。利用定向分子进化方法筛选酶学性能提高的突变体，进而通过序列比较分 析，获得ADTZ突变基因序列的生物学信息，可以进一步阐明酶的结构和耐受酸、 碱、高温的关系。这不仅可以获得特殊用途的高效酶，也为研究酶的性质与其相 关功能区域位置的关系提供了有用的数据和信息。 本工作采用易错PCR定向进化的策略，以黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)基因为模 板，进行error—pronePCR，向ADTZ基因引入突变位点，然后将PcR产物克隆到 a，并将含有ADTZ突变基因的重组质粒引入大肠杆菌 已成功构建的穿梭载体pYC DH5 a中扩增，抽提质粒后将之转入酿酒酵母S．cerevisiaeINVScl，建立突变文 库。 ADTZ定向分子进化中突变文库的筛选的总体策略为：利用快速测活体系，对 突变子进行高通量筛选。首先对突变库进行初筛，然后对酶活高于野生型的突变 体，在不同选择压力条件下(高温60℃处理、pH7．5、pH4．5处理后)进行复筛， 获得酶学性能较优的突变体作为DNA Shuffling的亲本基因。 DNA Shuffling重组突变文库的筛选首先经过上述的体系下的初筛和复筛， 获得在酶学性能方面更优的突变体，然后用AFBl测活体系对所获得这些突变株进 行检测，从中得到优良性质的突变体用于下一步的理性设计，进行点饱和突变的 研究。最后对筛选出来的耐高温的酶比活高的突变子进行测序．比较分析ADTZ突 变基因序列的生物学信息。 经过error-pronePCR建立一级突变库库容约为101的ADTZ突变文库，筛选 一级突变库得到高酶活突变体A1773，耐温性突变体A1242以及耐碱性突变体 有3个碱基发生了突变。结果见下图： ● ￡● I珥 ‘ ●H曩 ， 扣 警 Mx - ● 紫。 h s| ●¨3 l- 髓 _10。．赳嘲 I 吧 ● ■ 至tt ●-’ 13箦 ^，，薯■薯E量王P 叩 ● 乏 ～ ，对2挚 是、 ●● 蕞；‘ 誓∞ 辫 ■ ● 斟Z嗣 摊 ．_C‘■ ■气盖， 一4麓 ， 耋。： 倥● l，鼍；t l协 k-