酵母展示筛选scFv方法的建立.pdfVIP

l204 ISSNl007—8738细朐上 · 论著 · 文章编号：1007—8738(2009)12—1204—03 酵母展示筛选 scFv方法的建立 尹成凯，徐黎明，任桂萍，张 巧，刘向宇，田 辉 ，李德 山 (东北农业大学生命科学学院生物制药实验室，黑龙江 哈尔滨 150030) [摘 要] 目的：利用酵母展示技术建立筛选 seFvs的技术平 确的折叠和修饰。而酵母菌为真核生物，弥补了噬 台，为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础。方法： 菌体展示技术的此项不足，能使复杂真核蛋 白得到 改造 pYD1载体，将其 自身所带的GSLinker上下游两端突变 展示，同时又保留了噬菌体表面展示技术的便于筛 出酶切位点，构建成pYD-x；分别将 IL．1B抗体的重链与轻链 选、扩增等优点，继承了噬菌体展示的表现型与基因 可变区片段插入pYD—X中GSLinker的上下游 ，构建出重组质 型一致和易于扩增的特性 ，可根据编码蛋 白的特性 粒 pYSD1。从 pYSD1上PCR扩增出scFv片段 ，并将其插入 对 目的基因进行筛选 。 pYD1的MCS区，构建 出重组质粒 pYSD2。将 pYSD1与 pYSD2分别转入酿酒酵母 EBY100中诱导表达 seFv，并用流 目前国内还没有关于利用酵母展示进行筛选抗 式细胞术 (FCM)检测抗体展示情况。结果：经诱导后 ，从流 体的报道 ，此次实验利用了酵母展示细胞 EBY100展 式细胞仪检测结果中可以看出EBY100一pYSD1所展示的scFv 示重组抗人 IL一1BscFv片段 ，经流式细胞术 (FCM) 与抗原结合力很弱 ，而 EBY100一pYSD2则表现 出一定强度的 可检测出一定强度的荧光信号，证 明用于筛选 scFv 结合。结论：本实验证明了pYD—X载体上存在的额外的Gs 的平台已构建成功。此外，该 系统同时可 以用于 Linker对于抗体展示的必要性，并且成功建立了利用酵母展 scFv抗体的亲和力成熟，以提高抗体的亲和力，为今 示载体 pYD1进行 seFvs筛选的技术平台。 后筛选高亲和力抗体奠定了基础。 [关键词]酵母展示 ；pYD1；scFv；GSlinker [中图分类号]R392．11 [文献标识码]B 1 材料和方法 1．1 材料 pYDI(Cat．No．V835-01)购 自Invitrogen公司， 酿酒酵母是具有细胞壁的单细胞真核微生物， EBY100(Cat．No．V835-01)购 自Invitrogen公司，pEAI(含有抗 有两种交配型 MATa和 MATo~的单倍体细胞，这两 人 IL一1p抗体基因)由本实验保存 ，rhIL一1p(本实验表达)， 种细胞之间的相互交配融合是通过细胞表面表达a- FITCanti—humanIL一18antibody(Cat．No．1l-7018)购 自eBio— 凝集素和 ．凝集素的相互作用介导的¨。a一凝集素 science公司，DNAMarker购 自TaKaRa公司。 和仪一凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋 白 ， 1．2 方法 它们在酿酒酵母的这两种单倍体细胞之间介导细胞 1．2．1 目的基因的获得及重组载体的构建 以pEAI为模板， 与细胞的性黏附，使细胞融合形成双倍体 。本实验 PCR扩增出重链可变区(V )与轻链可变区(V。)，并在V 两端 所用系统为a