荧光定量PCR方法分析皱纹盘鲍HSP70在温度胁迫下的表达.pdfVIP

维普资讯 研究论文 ·哪。 Af=} E 荧光定量 PCR方法分析皱纹盘鲍 HSP70在温度胁迫下的表达 程培周 ，刘 晓 ，张国范 ，高其康。 (1．中国科学院 海洋研究所 ，山东 青岛266071；2．中国科学院研究生院，北京 100049；3．浙江大学 分析测 试 中心 ，浙江 杭州 310029) 摘要 ：根据皱纹盘鲍 (HaliotisdiscushannaiIno)HSP70和 ActinmRNA序列 ，设计合成 引 物 ，建立了皱纹盘鲍 HSP70的荧光定量 PCR技术平 台，并用于检测皱纹盘鲍在热激处理后 不同恢复时间HSP70的转录水平变化。结果表明在热诱导后 ，肌 肉组织 HSP70的表达呈 时间依赖性，存在先升高后降低 的趋势，在热诱导后 2h，肌 肉HSP70基 因的表达量 明显升 高，是对照组(0h)的 15倍 ，随后 HSP70的表达量继续升高，在诱导后 12h达到最高值 ，是 对照组的21倍 。然后表达量开始 回落，至热诱导后 96h，HSP70表达量降至初始值 ，表现 出 一 种 瞬时表达 的趋 势。 关键词 ：皱纹盘鲍 (HaliotisdiscushannaiIno)；热激蛋 白70；荧光定量 PCR 中图分类号 ：Q78 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3096(2007)10—0077—05 应激时机体组织细胞 内热激蛋 白(heatshock 激 时 HSP量变化 的原 因和机理 。 protein，HSP)的量会发生急剧变化 以稳定改变 了的 1 材料和方法 细胞 内环境 ，维持细胞 的生存 。HSP含量发生急剧 变化 的原 因可能是应激 时 HSP基 因转录水平 的变 1．1 材料和试剂 化 】]；热激蛋 白可能通过不 同的调节方式 由细胞核 皱纹盘鲍 (HaliotisdiscushannaiIno)取 自薛家 进入细胞质 ，在细胞各组织 中有选择地进行表达[2； 岛养殖场 ，平均壳长为 63mm_--+-4．5mm．在 16C控 也可能是 HSPmRNA的稳定性在应激时有所变化 ； 温 的沙滤海水暂养 ，气泵充气保证供氧 ，每天换水一 或者是在机体受到应激时，热激蛋 白的降解速度发 次，每天投喂海带 ，暂养 7d。将鲍从 16C海水取 出 生改变所致 3『]。HSP的研究 目前主要集 中在功能和 放入 3O℃海水 中保持 1h。然后放回到 16℃海水中， 表达调控两个方面 ，其 中HSPs的表达调控研究主要 处理后在不 同的时间(O，2，12，24，72和 96h)随机取 在转录和翻译两个水平 ，以前者为主 。因此正确度量 3头鲍的肌 肉组织于一80~C保存 。抽提 RNA。 应激反应过程中 HSPs含量 的改变是许多学者所关 注的重点问题之一 ，建立有效 的 HSPsmRNA 定量 Trizol购 自 Invitrogen 公 司 ；M—MLV，RQ1 方法也是非常必要 的。实时荧光定量 PCR(fluores— RNase—FreeDNase购 自Promega公司 ；PCR产物纯 cencequantitativePCR，FQ-PCR)技术是