青蒿分子标记体系初步研究.pdfVIP

成都中医药大学 04 级硕士论文 中 文 摘 要 中药青蒿来源于菊科植物青蒿(Artemisia annua.L)干燥的地上部分，其有效 成分青蒿素为抗疟特效药。青蒿素的生产主要依靠从青蒿植株中提取，而青蒿素 在青蒿植株中含量很低，且易受外界条件影响，青蒿不同基因型，不同个体之间 青蒿素的含量差异很大，这些遗传差异导致青蒿各个植株间青蒿素的含量差异， 因此，对青蒿进行品种品质评、遗传育种价等方面的研究日益重要。 分子标记作为遗传育种，品种鉴定，品质评价等研究的重要手段，具有较高 的多态性，遍布整个基因组，重复性好等特点。其中，ISSR 标记多态性来源于 SSR 间的序列变异，其重复性较好；SRAP 标记是对 ORF 进行扩增，具有简便、 稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点；基于反转录转座子的分子标记， 其多态性来源于反转座子的结构、组成、分布和逆转座的生物学过程，在种群间 及种群内都有较高的多态性。这几种分子标记在农作物中研究较多，而药用植物 研究鲜见报道，本文对青蒿进行了这几种分子标记的初步研究。 ISSR 和 SRAP 标记是基于PCR 的标记，其反应条件易受各种因素的干扰, 为 确保 ISSR 和 SRAP 分析结果的可靠性和重复性，本文通过对 PCR 反应体系中的 模板 DNA 、Taq DNA 聚合酶、dNTP 以及Mg2+浓度，引物退火温度等的最佳反 应条件进行探索，建立了适用于青蒿的优化的 ISSR、SRAP 反应体系。 建立反转录转座子分子标记，首先应克隆其基因序列。在 LTR 类反转录转 座子中，具有编码负责 RNA 的成熟和包装蛋白质的 gag 基因，编码反转录酶的 RT 基因，编码整合酶的 int 基因和编码核酸酶的 RNaseH ，可以根据这些结构基 因保守区域设计引物，进行克隆。 本文采用同源克隆法克隆青蒿的反转录转座子基因序列，参照 Pearces 等人 建立的在植物中快速分离反转录转座子的长末端重复序列的方法，根据编码核酸 酶的 RNaseH 基因的两个保守序列设计引物，提取青蒿总 DNA 后，采用限制性 内切酶酶切，接头连接，通过保守序列引物和接头引物进行巢式 PCR 扩增，回 收扩增产物，将目的片段与质粒载体连接，重组载体经电击转化大肠杆菌，用菌 落 PCR 法筛选克隆，检测合格的克隆进行序列测定。测得序列采用在线方式经 NCBI 的Genbank 选择 Blastx 做序列比对，初步确定该序列为 Ty3-gypsy 类反转 录转座子的部分序列，Genbank 序列号为：EF422339 。 关键词：青蒿 ；ISSR 标记；SRAP 标记；反应参数优化；反转录转座子； RNaseH 基因；巢式 PCR ；基因克隆 i 成都中医药大学 04 级硕士论文 Abstract Artemisinin is a new effective antimalarial drug extracted from the Chinese medicinal plant Artemisia annua L .The production of artemisinin is mainly depend on extracting from wild plant, but the yield is very low, and environmental factors can highly effect its content which has a great difference between different genotypes. Because of these heredity differences which play an important role in the process of chemosynthesis and