大肠杆菌感受态细胞制备及转化.pptVIP

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验原理 实验仪器 实验试剂 实验步骤 注意事项 实验原理 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。 实验仪器 1 ．超净工作台 2 ．低温离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．-70 ℃ 冰箱 6 ．制冰机 7 ．移液器 50ul 、200ul 、1000ul 实验试剂 １．氨苄（母液50mg/ml，终浓度为50ug/ml）： 2ml母液需氨苄100mg ２．CaCl2(终浓度20mM)：需贮液1M 、20ml，需 CaCl2固体4g ３．MgCl2(终浓度80mM)：需贮液1M 40ml，需 MgCl2固体4g ４．甘油：500ml 实验步骤 CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1． 前夜接种受体菌（DH5?或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上 操作； 4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 6 ．弃去上清，加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤 1．前夜接种受体菌（DH5?或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.6（约2.5-3小时）； 3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5．4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6．弃去上清，加入1500?l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 7． 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8．弃去上清，加入750?l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 9． 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10．加入20?l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11．立即使用或迅速置于-70oC超低温保存。 注意事项 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使 用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率； 6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比； * * 制作人：李国婧 内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心