结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合基因稳定转染细胞系的建立.pdfVIP

第9卷 第 11期 2009年6月 科 学 技 术 与 工 程 Vo1．9 No．11 June2009 1671—1819(2009)11·2899—04 ScienceTechnologyandEngineering @ 2009 Sci．Tech．Engngr 医药卫生 结核分枝杆菌HSP65．hlL．2 融合基因稳定转染细胞系的建立 王丽梅 徐志凯 柏银兰 张 薇 康 健 师长宏h (第四军医大学基础部微生物学教研室，实验动物 中心 ，西安 710032) 摘 要 建立可稳定表达结核分枝杆菌HSP65一hIL-2融合蛋白的稳定转染P815细胞系。在阳离子脂质体作用下，将 HSP65一 hIL-2真核表达质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815细胞(H-2)。G418筛选阳性克隆，RT．PCR和间接免疫荧光法检测 目的蛋 白的转录和表达。阳性克隆细胞经RT-PCR检测到HSP65一hlL-2融合基因特异性的mRNA表达；用鼠抗人的IL-2mAb 进行间接免疫荧光检测，可在转染的P815细胞浆中观察到较强的绿色特异性荧光，而未转染细胞则为阴性。成功获得稳定 表达HSP65一hlL-2融合蛋白的稳定转染细胞系，为其疫苗的CTL研究提供 了合适的靶细胞。 关键词 结核分枝杆菌 稳定转染 HSP65hlL-2 中图法分类号 R378．911； 文献标志码 A 结核病(TB)是危害人类健康的主要疾病之一， 表达 HSP65一hIL-2融合蛋 白的细胞株，为评价 每年因TB死亡的人数达 200多万，新发病例达800 HSP65-hIL-2融合蛋 白的TB新 型疫苗研究奠定 多万 ¨。卡介苗(BCG)是 目前唯一用于预防TB的 基础。 疫苗，但其保护效果不稳定 J，因此对TB新型疫苗 的研究具有重要意义。 1 材料和方法 当前TB新型疫苗的种类较多，包括 DNA疫 苗、亚单位疫苗、重组分枝杆菌活疫苗和减毒活疫 1．1 材料 苗等 J。结核分枝杆菌 (MTB)是一种胞内菌，机体 小鼠肥大瘤细胞系P815细胞 (H-2)由本室保 抗MTB感染主要依靠细胞免疫，而 CTL效应是评 存。真核表达载体 pcDNA3．1一HSP65一hIL-2由本室 价疫苗激发机体产生细胞免疫应答的重要指标之 构建保存 ]。大鼠抗人的IL-2mAb购 自LABVI． 一 【4J。 建立合适的靶细胞是完成 CTL反应的必要 SION公司，FITC一羊抗鼠IgG和FITC一羊抗大鼠IgG 条件 ，它不仅要有与效应细胞一致的MHCI类分 均购 自武汉博 士德公司，FuGene6脂质体购 自 子，而且还需要有能被 T淋巴细胞识别的抗原表 Roche公司，G418购 自Sigma公司，质粒提取试剂盒 位 J。以遗传背景与 BALB／c小鼠一致的P815细 购 自Omega公司。AMV、RNA酶抑制剂和TRIzol为 胞(H-2)为靶细胞，将 MTBHSP65一hlL-2融合基因 Promega公司产品，DNAmarkerDL2000购 自Takara 真核表达载体稳定转染P815细胞，以筛选获得稳定 公司。 1．2 方法 2009年2月 17日收到 国家 自然科学基金 资助 第一作者简介：王丽梅，女(1979一 )，博士，讲师。E．mail：lira． 1．2．1 细胞培养和G418工作浓度的筛选 wang@