棉花细菌人工染色体的荧光原位杂交（BAC-FISH）技术.pdfVIP

维普资讯 PIL]I]鬻 … Ⅵ nⅣ．pibb．ac．cn 棉花细菌人工染色体的荧光原位 杂交 (BAC．FISH)技术 木 王 凯 张燕洁 关 兵 郭旺珍 张天真 ” (南京农业大学作物遗传与种质创新 国家重点实验室。南京 210095) 摘要 细菌人工染色体荧光原位杂交 (BAC—FISH)技术是植物染色体识别、物理作图等分子细胞遗传学研究的重要工具，但 对于某些物种尤其是多倍体植物，由于大量重复序列的存在等问题，使得该技术应用受到很大的限制．通过选择棉花分子遗 传图中高重组区的微卫星位点 (simplesequencerepeats，SSR)标记的策略，筛选到不含或含有少量重复序列的细菌人工染色 体 (BAC)克隆，同时，在通用 FISH技术程序基础上 ，通过改进发根 、变性 、洗脱条件等步骤，构建 出适合于棉花的 BAC-FISH技术，简化了操作流程的同时，获得稳定的杂交结果及较高的检出率；并通过将一随机获得的BAC进行染色体 的物理定位，进一步引入双探针、双色及重复杂交技术，显示了该技术的成熟与 良好的应用前景和价值． 关键词 棉花，细菌人工染色体，荧光原位杂交 学科分类号 Q37，Q23 DNA荧光原位杂交(FISH)是20世纪80年代末开 棉花是重要的经济作物，棉纤维是世界上主要 始发展起来的一种重要的非放射性标记原位杂交技 的纺织原材料[】61． 1995年，Hanson等E,,1N用Cot一1 术 ．随着技术 的不断改进，探针类型从最初的 DNA为探针与I1个棉花大插入片段BAC克隆DNA DNA重复序列和多拷贝基因家族 【l·发展到单或低拷 杂交，并从中筛选出不含重复序列的单拷贝克隆， 贝序~lJ2[1，现今它已被广泛地应用于动植物基因组 进行FISH杂交．这是BAC．FISH技术在棉花上应用 结构和DNA分子物理图谱的构建研究中，【． 的首次正式报道 ．但它与现今的BAC．FISH不同， 细菌人工染色体荧光原位杂交 (BAC．FISH)是 他们是利用Cot．1DNA为探针与克隆进行DNA杂 以细菌人工染色体 (BAC)克隆作为探针进行的染 交，从中选出单拷贝序列的BAC克隆用于原位杂 色体原位杂交，由于克隆的外源片段一般为100kb 交，而非将Cot．1DNA用于探针封阻，其技术流程 以上，其探针与靶DNA序列相遇的机会大，杂交 较 为复 杂 ． 同年 ，Jiang等 [10l即报 道 了改进 的 信号检出率大大提高．因此，它较单拷贝或低拷贝 BAC．FISH技术，利用Cot．1DNA与探针预杂交进 小片段DNA序列杂交更为容易，而且准确可靠 ， 行探针封阻，将该技术成功应用到水稻中．简化了 从根本上克服了过去单拷贝DNA杂交的困难 ，大 操作步骤的同时大大提高了可用探针的数量，而且 大促进植物尤其是二倍体物种基因组的研究，现已 避免了使用DNA杂交造成的繁琐，BAC．FISH从此 成为植物核型分析6[-91、基因定位及物理图谱构 在植物中开始得到广泛的应用．但遗憾的是，作为 建m【叫4】等分子细胞遗传学研究的有力工具．但是， 重要经济作物之一的棉花，至此却再无应用报道． 由于BAC克隆片段的长度增加，其往往含有大量重 现今，随着棉花基因组学研究的深入，高密度的遗 复序列，特别是对于基因组中重复序列含量高的物 传图谱以及BAC文库的成功构建，迫切要求对于核 种如六倍体小麦，四倍体棉花、油菜、马铃薯等， 导致杂交后较强的背景干扰，使得该技术的应用受 ·长江学者和创新团队发展计划资助项 目(IRT0432) ”通讯联系人． 到很大的限制，至今，在多倍体植物 中BAC—FISH Tel：025—8439531l，E—ma