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人宫颈癌FHIT启动子甲基化的研究 张利平陈蒇李旭 (西安交通大学医学院第一附属医院实验医学中心) DNA甲基化是一种发生在CpG二核苷酸上对胞嘧啶的共价修饰，是由5’．腺苷蛋氨酸 (SAM)提供甲基，在细胞内DNMTs催化作用下，于DNA复制后形成5’·甲基胞嘧啶的反应 f∞。通过对前列腺癌、乳腺癌、食管癌、肺癌和宫颈癌细胞FHIT基因5’端CpG岛高甲基化 的研究，发现此区域的高甲基化可导致FHIT基因失活，参与肿瘤的发生。目前，国内外有 关宫颈癌与FHIT基因甲基化的研究报导不多，结论不一致。因此本研究采用MSP PCR)技术检测正常宫颈组织、宫颈癌组织和人宫颈癌细胞株FHIT (Methylation·specific 基因5’端CpG岛甲基化水平，并使用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理细胞株，观察甲基 化水平改变。旨在揭示FHIT基因在人富颈癌组织和细胞中的甲基化模式，探讨FHIT基因 甲基化与宫颈癌病理分型、临床分期之间的关系， 并研究5-Aza．CdR 寻找宫颈癌诊断和治疗的新方法提供理论和实验依据。 1材料和方法 1．1病例来源 2003年9月至2005年9月收集于西安交通大学医学院第一附属医院妇产科及放疗门 诊，未经放、化疗的性宫颈癌组织，所有标本均经病理学诊断确定为鳞状上皮组织癌。患者 年龄34．70岁，平均年龄49岁。正常宫颈组织为子宫肌瘤、子宫腺肌症行全子宫切除术，病 理证实为正常宫颈者，标本分别置于液氮和．70C保存。 1．2细胞株 RJC-1、CSl213细胞是中心自建。 1．3引物设计 据文献设计引物，经过MSP专业引物设计网站： [作者简介]张利平，女，西安交通大学医学院硕士研究生。导师，陈葳副研究员。现就职于陕西省妇幼保 健院遗传室。研究方向：分子遗传学 ．．294．． 1．html http：／／www．ucsf．edu／urogene／methprimer／index analysis／index．html． Biology／DNA／Methylation http：／／www．protocol-online．org／prot／Molecular 进行引物序列比对后确认无误，由上海博亚生物技术有限公司合成。 1．4FHIT基因启动子区甲基化分析 双蒸水稀释DNA，加入3MNaOH，混匀，37℃水浴lOmin-20 Bisulfite DNA纯化回收试剂盒纯化、脱硫收 轻轻摇匀，3．6M 55C温浴18小时。Oiagen 集甲基化DNA。PCR反应条件：94．1C3min，94C30s，65C30s，72X230s，40个循环，72C延伸 Buffer混合．上2％琼脂糖凝胶。并以作为分子量参照 7分钟。取PCR产物与6XLoading 标准进行产物鉴定，凝胶成像分析系统分析并照相。 1．5甲基化转移酶抑制剂5一杂氮一2一脱氧胞嘧啶核苷作用 接种细胞5X]04／mi，贴壁6小时后，应用0．1mM／L5-Aza吒d连续作用于细胞72小时，检测其 甲基化水平。选取对5-Aza-CdR敏感的C33A细胞，进行限制性内切酶HapIF[酶切分析其基因 组甲基化水平，旺染色观察药物处理后细胞的形态学改变，并用流式细胞仪分析细胞周期的 改变。 2结果 2．1正常宫颈和宫颈癌组织中的FHIT基因甲基化的检测 甲基化引物扩增ll例正常宫颈组织未见阳性条带，而49例宫颈癌组织中有36例可见 73bp产物。正常富颈和宫颈癌组织中FHIT基因5’CpG岛甲基化发生率分别为0％和73．5％， 差异有显著性(P0。05)。Ii例正常宫颈上皮组织和37例宫颈癌组织扩增出未甲基化目的 片段，未甲基化特异性引物扩增正常宫颈上皮与宫颈癌组织的DNA阳性率为100％和75％， 差异无显著性(PO．05)，36例检测有FHIT甲基化的宫颈癌标本中有9例用未甲基化引物 不能扩增出73bp目的片段。 2．2富颈癌细胞株F