细胞工程实验教案-商丘师范学院生命科学学院》》首页.docVIP

细胞工程实验指导书 商丘师范学院生命科学系  ? ? 目录 实验一 培养基母液的制备------------------------------------2 实验二 培养基的配制与灭菌----------------------------------5 实验三 培养材料灭菌和接种----------------------------------8 实验四 愈伤组织的诱导与增殖--------------------------------10 实验五 细胞原代培养----------------------------------------12 实验一 培养基母液的制备 ? 一、实验目的与意义 学习和掌握培养基母液的配制方法。 在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 二、实验器材 电子分析天平（感量为0.0001g）、扭力天平（感量为0.01g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（500ml、100 ml）、细口瓶（1000 ml、200 ml）、药勺、玻璃棒、电炉。 三、实验药品 NH4NO3、?KNO3?、CaCl2、?MgSO4·7H2O、KH2PO4?、?KI?、 H3BO3?、 MnSO4·H2O、 ZnSO4·7H2O、 Na2MoO4·2H2O?、CuSO4·5H2O?、CoCl2·6H2O?、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O?、肌醇 、烟酸?、?盐酸吡哆醇(维生素B6)??、盐酸硫胺素(维生素B1)?、甘氨酸?。??????????????????? 四、实验步骤 1、大量元素母液的配制 各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，用电子天平或扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到500ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。 表1 MS培养基大量元素母液制备 序号 药品名称 培养基浓度（mg/500ml） 扩大10称量(mg) ?配制体积(500 ml) 1 NH4NO3 825 8250 ? 蒸馏水定容至500ml 2 KNO3 950 9500 3 CaCl2? 160.5 1605 4 MgSO4·7H2O 185 1850 5 KH2PO4 85 850 注意： (1) 配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。 (2) CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。 ２、微量元素母液的配制 MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，特别是?CuSO4·5H2O、?CoCl2·6H2O?，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的电光分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量Ⅰ10 ml，微量Ⅱ１ml ? 表2 MS培养基微量Ⅰ的配制 序号 化合物名称 培养基浓度（mg/500ml） 扩大100倍称量 (mg) 配制体积 (500 ml) 1 MnSO4·H2O 8.19 819 2 ZnSO4·7H2O 4.3 430 蒸馏水定容至 3 H3BO3 3.1 310 500 ml 4 KI 0.415 41.5 5 Na2MoO4·2H2O 0.125 12.5 ? 表3 MS培养基微量Ⅱ的配制 序号 化合物名称 培养基浓度（mg/500ml） 扩大1000倍称量(mg) 配制体积 (500 ml) 1 CuSO4·5H2O? 0.0125 12.5 蒸馏水定容至 2 CoCl2·6H2O?? 0.0125 12.5 500 ml ? 注意： 使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。 3、铁盐母液的配制 铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的