阴离子交换蛋白折叠色谱与MALDI-TOF+MS联用对还原变性牛胰岛素折叠的研究.pdfVIP

第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 o．B024 阴离子交换蛋白折叠色谱与MALDI．TOFMS联用对还原变性牛 胰岛素折叠的研究 林翠娥 白 泉” 西北大学现代分离科学研究所，合成与天然功能分子化学教育部重点实验室，西安710069， MS 关键词：蛋白折叠，液相色谱，还原变性，胰岛素，MALDI．TOF 在基冈丁程中，重组蛋白的生产主要是通过外来宿主细胞进行表达，但是许多外源基因在大肠 杆菌(E．coli)中高效表达时，常常以不溶的无活性的沉淀即包涵体的形式聚集于菌体中。如何将无生 物活性的包涵体折叠成可溶的、具有生物活性的重组蛋白，即蛋白折叠问题已成为现代生物工程体 系中的技术瓶颈。对于含有二硫键的包涵体蛋白，必须在还原剂，如肛巯基乙醇或二硫苏糖醇(D邢 存在的条件’卜．，用高浓度的变性剂将包涵体溶解，然后再将还原变性的蛋白进行氧化复性，以得到 具有活性的蛋白质。所以如何提高变性蛋白二硫键的正确配对率对重组蛋白药物的生产具有重要的 意义。 通常包涵体蛋白的复性主要采用稀释法和透析法，但是其复性效率非常低，只有50／旷20％。近 年来液相色谱技术被应朋蛋白折叠研究，已成为蛋白复性并同时纯化的有力工具，称之为蛋白折叠 模型蛋白，采用阴离子交换色谱与基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI．TOFMS)联用对 还原变性的牛胰岛素在液固界面上的折叠规律进行研究。 mol／L脲 溶液对其进行还原变性。将还原变性的牛胰岛素用RPLC分离后，并用MALDI．TOF MS检测，结果 表明，胰岛素的二硫键已完全打开而变成了A、B两条链。 8．0 将200“L mmol·L‘1Tris+1．0 流动相1(A液，20 8．O；B液，20 8．0)进行30min线 mm01．L～Tris，pH mol·L～NaCI，pH 性梯度洗脱，收集胰岛素色谱馏分并经RPLC分离后采)-lqMALDI．TOFMS对RPLC的色谱馏分进行测 别是胰岛素A链和B链及其Na+和氰脲酸的修饰物，仅有4号峰为胰岛素，且和天然胰岛素在RPLC的 保留时问相同。但是，4号峰太小了，所以采用普通流动相时还原变性的牛胰岛素二硫键基本不能正 确配对，不能使其折叠复性。 通常还原的二硫键需要在氧化剂存在下才可以进行正确配对。实验中在离子交换流动相中分别 mmol·L。1Tris+1．8mmol·L‘1 mmol·L’1Tds+1．0mol·L。I 8．0； B液：20 Cyst+O．3mmol·L—GSSG，pH NaCI+1．8mmol·L’I Cyst+0．3mmol·L—GSSG，pH8．o)，还原变性牛胰岛素二硫键的正确对接率可人 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集 人的提高f幽1-2中色谱峰4’所示1。 为了进一步减少还原变性蛋白在色谱柱上的聚积沉淀，增人浒c动相的洗脱能力．除在流动相中 L1脲，研究了脲梯度对折叠效率的影响．结果发明采 加入cy$VGSSG外，还在B液中加入8．0tool ris+l8mmolL 川脲梯度洗脱(流动相3．A液：20mmoi0Ii 8．0；