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星型厶芏鲤!型[2‘：L垡生5z坚! 盐旦避￡垃丝地△丛：理!丛j!j避型基盟厶煞控丝丝氇堑殴垫强丛堙 蛛网膜下腔移植APA．NIH3T3／rPENK 对大鼠神经性疼痛的镇痛效应 研究生王振全 导帅臧p东教授张宏伟副教授 郑州大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学 河南郑州450052 摘要 背景和目的 神经性疼痛是由神经系统损伤或功能障碍所导致的，它足一种痛苦的神经疾 病，目前传统的镇痛药尚不能有效地治疗。脑啡肽作为一种内源性阿片肽，其主 要作用足通过抑制疼痛信息的传递来发挥镇痛效应。利用逆转录病毒载体，经过 包装细胞系的包装，可将脑啡肽基因整合到靶细胞基因组中长期稳定表达。因此， 可将转脑啡肽基因细胞移植于病人脊鬣蛛网膜下腔，用于治疗神经性疼痛。然而 潜在的宿主影响和严重的排异反应是异种移植不可避免的问题，为了防止移植捧 异反应，本研究应用海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠(APA)的方法将转脑啡肽基因 神经性疼痛的镇痛效应，检测大鼠脑脊液中脑啡肽含量的变化以及脊髓背角 NMDAR2B蛋白的表达强度，探讨移植镇痛机制，同时了解APA微囊的免疫隔离效 果，为APA—NIIl3T3／rPENK脊髓蛛网膜下腔移植镇痛技术的临床应用提供实验依 据a 方法 l、囊化细胞培养观察及脑啡肽分泌检测 利用高压静电微囊制作仪，将转鼠脑啡肽基因NIH3T3细胞进行APA微囊化 操作，混悬于含l096胎牛血清的DMEM中，37’C，5％C02的孵箱条件下培养，镜下 观察囊内细胞生长状况，每隔1天检测分泌到囊外的目的基因产物脑啡肽的浓 整趟厶芏鲤!盟韭：l建童!巡2 丛丝避￡整毪垃盎坠：M世≥卫![￡E醚K型厶鲢挫丝世丝熊曲啦盐熟缝 度。 2、观察神经性疼痛动物模型热痛闽，叟化规律 20只成年雄性sD人鼠被随机均分成2组：CCI模型组、CCI模型假手术组。 CCI模型组，结扎右侧坐骨神经；CCI模型假手术组，仪暴露出右侧坐骨神经， 不做结扎。术后第5天开始测量左右爪热痛阈，隔天测量1次，测量6周。 3、移植脱察镇痛效应 30只成年雄性sD大鼠被随机均分成3组：空囊组(APA组)、裸细胞组 u 天，APA组向大鼠蛛网膜下腔植入40l空囊悬液，约含空囊300个： NIH3T3／rPENK组向大鼠蛛网膜下腔植入40ulNIH3T3／rPENK悬液，约含细胞 IAPA—NIH3T3／rPENK 2×l∥个；APA—NIH3T3／rPENK组向大鼠蛛}c)9膜下腔植入40p 悬液，约含细胞2×106个。 热痈阈测定：移植后第2天开始测量术侧后爪热痫阈，开始每天测量一次， 5天后隔天测量，测鼍截IL到移植术后2l天。 拮抗剂实验：移植术后第1l天，3组大鼠分别腹腔注射阿片受体拮抗剂… 纳洛酮(0．08mg／kg)。观察对止痛效果的影响。 人工脑脊液灌流：用恒流输液泉将人工脑脊液灌入大鼠蛛嘲膜下腔，冰浴 下收集脑脊液灌流液约iml，沸水火活，离心取上清，保存于一20C待测。放射免 ’ 疫法检测脑啡肽含量。 NMDAR2B蛋白表达：移植术后第21天，应用NMDAR2B抗体进行免疫组织化学 染色来鉴定脊髓背角NMDAR2B蛋白的表达强度。 结果 1、囊化细胞培养观察：随着培养时间的增加，细胞开始向周围增殖分裂并 逐渐聚集生长。到第12天时，可见形成克隆状细胞团；囊膜对目的基N产物脑 啡肽的通透性检测：培养第3天，脑啡肽浓度为12．9±1．6pg／ml，到第1l天， 增加达到197．O±38．Ipg／ml。随着细胞在囊内的逐渐扩增，分泌到囊外的脑啡 肽呈现出明显增加趋势。 2、神经性疼痛动物模型热痛阙变化规律：CCI术后5天，坐骨神经结扎侧 热痛阈低于对照侧，但差异不明显(PO．05)；CCI术后7天坐骨神经结扎侧 n 竖搅厶芏熊!缝2L：!：坠童12堂2