南昌大学科学技术学院 基因工程.docVIP

基因工程期末复习 第一章：基因工程 1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。 2. 基因工程研究的主要内容或步骤： 基因克隆的通用策略 ：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。 ①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； ②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子； ③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； ⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； ⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 3.三大元件：载体、质粒、片段。 第二章：分子克隆工具酶 1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。 2、限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶） 3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 4、回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。 5、同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37度）④DNA的分子结构。 星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性（star activity)。 8、Ｔ该酶常从Ｔ噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ连接酶。 ①反应温度：连接缺口的温度：37℃；连接粘性末端的最佳温度： 4～15 ℃。 ②Ｔ连接酶DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间。 ③提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）。 10、常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法。 11、DNA聚合酶：DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。依赖于DNA的DNA聚合酶： DNA聚合酶Ⅰ(全酶)；DNA聚合酶Ⅰ大片段 (klenow片段)；耐热DNA聚合酶(Taq 酶)；依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶。 12、DNA聚合酶Ⅰ活性：三种酶活性①5’ →3’DNA聚合酶活性②5’ →3’③3’→5’ 核酸外切酶活性。 13、逆转录酶：以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。5’ →3’合成DNA，无3’→5’外切活性。 第三章 分子克隆载体 1、载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具。（克隆载体、表达载体） 来源：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体载体、病毒载体。 二 .质粒：染色体外的遗传因子，能自我复制，多数为双链闭环DNA，大小1KB-200KB 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低。 三大特性：自我复制、克隆位点、筛选标记（其他如易分离纯化，具有启动子） 1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS）。 3、有适合的标记，易于选择。 表达性质粒载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。 主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。 1.构型：SC型共价闭合环形DNA（ccc DNA）、OC型开环DNA（ocDNA）、L 型线性DNA。 2.质粒DNA的复制类型：（拷贝数的多少）：严谨型、松弛型 质粒 复制子 拷贝数 pBR322 pMB1 15-20 pUC pMB1 500-700 pACYC P15A 10-212 pSC101 pSC101 -5 Co1