石蜡包埋组织中目的基因原位逆转录-聚合酶链反应检测.docVIP

石蜡包埋组织中目的基因原位逆转录-聚合酶链反应检测 遵医医学院病理教研室（365003）肖庆邦，揭伟，郭瑞珍，唐文台，梁群英 传统的对目的基因的原位检测方法如免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）由于实验系统本身的局限性，在检测某些低拷贝或单拷贝基因序列时往往失败。原位逆转录-聚合酶链反（IS-RT-PCR）应作为一种新近发展起来的生物学方法，在检测这些低拷贝或单拷贝基因序列时有特殊的价值和意义。我们今采用直接法IS-RT-PCR，从普通制作的石蜡包埋组织中检测到待检基因序列。 1材料和方法 1.1组织标本 遵义医学院附属医院病理科存档普通石蜡包埋淋巴瘤组织块6μm切片，经0.1%DEPC水处理，表片于专用原位PCR载片上，每一载片上贴3块组织，75℃烤4h，置4℃冰箱内备用。 1.2原位RT-PCR 1.2.1 PCR引物 本组待检基因组序列为丙型肝炎病毒基因序列，参考有关文献设计引物 [1]，由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物序列如下：正义 5’ (36nt) –CTGTCAGGAACTACTGTCTTC-(56nt)3’，反义5’(292nt)- CCCTATCAGG CAGTACCACAA-（272nt）3’。 1.2.2组织预处理 切片脱蜡至水，空干，室温下阻断内源性过氧化物酶30min，无水乙醇洗3min，空干；10mg/L蛋白酶K37℃消化10min，0.1%DEPC水终止酶反应5min，入无水乙醇1min，空干。1U/mlDNase37℃消化2h，0.1%DEPC水1min，入无水乙醇1min，空干。 1.2.3原位逆转录 每例组织加反应混合液（1×RT缓冲液、5.0mmol/LMgCl2、0.2mmol/L Oligi（dT）、1mmol/LdNTP、4OU RNasin、10U AMV逆转录酶，以上试剂均为Promega公司产品），以盖住组织为准，平均15μl。加入反应混合液后，盖专用盖玻片（Sigma产品），指甲油封边，置42℃温育箱温育1h，去掉封胶，在无水乙醇中洗脱盖片，入0.1%DEPC水1min，无水乙醇1min，空干。 1.2.4原位PCR及产物检测 反应体系各组份终浓度为：1×PCR缓冲液、4.5mmol/LMgCl2、0.2mmol/LdNTP、0.2mmol/Lbio-11-dUTP、0.8μmol/L HCV RNA引物（正义、反义）、10U Taq酶。盖上盖玻片后指甲油封边，置原位梯度PCR仪（Mastercycler gradient，Eppendorf产品）循环，94℃预变性3min后按94℃30sec，45℃45sec，72℃60sec，循环25个周期，最后72℃延伸10min。 扩增后玻片浸入无水乙醇中，去掉指甲油及盖玻片，依次入1×SSC（0.2%BSA）5min、0.1×SSC（0.2%BSA）5min、0.1mmol/LPBS5min后， Avidin-辣根过氧化物酶（1︰25）4℃冰箱湿盒过夜亲和孵育，DAB显色，封片，镜检。 以确诊的HCV感染的肝炎组织（由复旦大学病理学教研室胡锡琪教授、朱世能教授惠赠，已确诊HCV感染阳性）作阳性对照,分别以DEPC水代替Taq酶、HCV引物和Oligo(dt)作阴性对照。 2 结果 根据文献[2]，HCV RNA阳性结果主要定位于胞核与胞浆交界处，即核周，亦可见胞浆着色。光镜下观察，以核周或胞浆出现棕黄色或信号为阳性，无该信号出现者为阴性。结果，石蜡切片组织上检测到阳性信号，阳性信号呈点状散在分布。（图1，图2） 3讨论 自从Nuovo[3]系统地介绍原位RT-PCR技术以来，已有报道应用该技术在组织细胞中检测到了某些低拷贝或单拷贝基因。 传统观点认为原位PCR标本要求特殊，主张采用新鲜标本，且对固定液的选择、固定时间、石蜡块制作等均有严格的要求。这在检测RNA时，尤为突出。这是因为组织本身及标本制作过程中各种外界的因素均可引起目的基因的破坏和降解，但在检测某些目的基因组序列尤其是病毒基因组时条件可以放宽。福尔马林被认为是蛋白的优良固定剂，且价格低廉，普遍应用于临床病理工作中。检测病毒基因组不同于真核生物组织细胞基因组，这是因为病毒外包有一层蛋白外壳，阻止了病毒核酸与周围组织及外界的接触，在一定程度上防止了核酸被分解。Fujita等[4]发现，在超速离心过程中加入中性福尔马林后，丙型肝炎患者血清样本中丙型肝炎病毒的检测浓度较无福尔马林者显著提高，提示福尔马林等对病毒有保护作用。本组采用的就为存档多年（部分存档时间达5年）的普通制作的石蜡包埋组织。 标本消化是原位PCR中至关重要的一环，直接关系到PCR的成败。病毒基因组由于有蛋白外壳，蛋白酶不仅要消化组织，还要消化蛋白外壳，消化程度较检测组织基因组更难掌握。消化不