双酶偶联核酸分子识别体系建立与初步优化研究.pdfVIP

双酶偶联核酸分子识别体系的建立与初步优化 中文摘要 研究生：陈成立 导师：李凯教授 廖端芳教授 目的：研究DNA连接酶与DNA聚合酶偶联的核酸分子识别体系的反应条件及 影响因素，在此基础上探讨优化途径以增加识别特异性和检测灵敏性，进一步探索其 在现代医药研究的作用。 方法：选取HⅣ一1 pol基因保守区长度为190bp的一段序列作为检测的靶序列。 设计三条不同长度部分互补的单链DNA长引物，扩增合成HIV检测用模板。基于待 检测序列，分别设计上下游内侧半引物与外侧半引物，运用半引物连接成全引物后在 聚合酶介导下对目的序列进行特异性扩增的方法，有机的将连接酶的连接反应与聚合 酶的扩增反应偶联起来对待测模板进行多位点特异性识别。在连接反应中，DNA连 接酶介导配对的半引物连接成全引物；而在后续PCR反应中，P血DNA聚合酶又可 介导全引物对待测模板进行识别性扩增。其中，在连接反应中特别引入半模板介导半 引物连接成全引物，以增加反应特异性和实验结果可靠性。在连接酶连接以及高保真 聚合酶介导延伸过程中，连接酶对连接位点的识别以及高保真聚合酶对全引物与待测 模板的识别偶联起来，达到对待测模板多点辨认的效果。在前期实验的基础上，研究 反应条件改变与识别特异性和敏感性的相互关系，为进一步优化偶联核酸分子识别体 系提供参考。 结果：用三条人工合成长DNA序列A、B、C互为模板互为引物的方法，在55C 的退火温度下方便快捷的合成了检测模板。两步法中，在内侧半引物对浓度保持不变 的情况下，增加外侧半引物对浓度，偶联体系反应效率逐渐升高；在外侧半引物对浓 度保持不变的情况下，增加内侧半引物对的浓度，偶联体系反应效率迅速升高。内／ 外侧半引物对没有连接成全引物情况下，扩增反应无特异扩增产物产生；只有连接成 的全引物，才会在后续的PCR反应中介导模板的特异性扩增。在连接反应中，内／外 侧半引物对浓度比变化的同时，改变参与后续PCR扩增反应的连接反应产物的量， 导致偶联反应的结果也不同。在考察浓度范围内，随着连接产物稀释度增加，后续扩 增产物正比减少。内侧或外侧半引物对的缺失实验显示，其单独存在情况下，可介导 待测模板的微弱扩增，连接酶反应体系对聚合酶反应体系影响很小。同时，通过采用 半模板，可以减少人工模板的干扰。在一定程度上，短内侧引物对相较长内侧引物对 而言，可增加偶联核酸分子识别反应的灵敏度。此外，单管法反应底物之间干扰大， 有待于结合具体检测对象，进一步进行反应条件研究。 结论：(1)DNA连接酶与DNA聚合酶偶联的核酸识别体系可以达到对目的基 因片段高灵敏高特异的识别，具有极大的方法学优势和应用价值。(2)两步法进行双 酶偶联反应条件已经成熟，有待临床检验。(3)相对而言，单管法具体反应条件有待 于进一步研究。 关键词：PCR；DNA连接酶；DNA聚合酶；偶联；半引物 2 and of PreliminaryApplication Development the ofDNA andDNA for cooperationsystem polymeraseligase Detection Rapid (Abstract) Aim：The and ofthe of improvementexploratorydevelopmentcooperationsystem DNA andDNA inone orall