人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

2010年2月 第23卷 第2期 JMedPostgra，Vo1．23，N．， ! ·117 · 论 著 (基础研究) 人 SET基 因小分子干扰 RNA重组腺病毒载体 的 构建与鉴定 许波群，李 瑛，薛 凯，李 梅，马 翔，刁飞扬，崔毓桂，刘嘉茵 [摘要] 目的 SET基因表达产物是SET／TAF．1p蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程， 多水平 、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表 达人SET基因的小分子干扰RNA (siRNA)重组腺病毒载体。 方法 根据 siRNA靶序列设计并合成2条互补的64bp寡核 苷酸。pshuttle．Hl穿梭质粒经 Ⅱ、Hindm双酶切后，与退火的寡核苷酸连接 ，构建穿梭质粒pShuttleH·1一siRNA。该穿梭质 粒经NotI和Hind111双酶切后与 pAdTrack．CMV连接，构建含有绿色荧光蛋 白(greenfluorescenseprotein，GFP)报告基因的穿 梭质粒PATC—H1一siRNA。分别将腺病毒骨架质粒 pAdEasy一1和穿梭质粒PATC—H1一siRNA转化至 BJ-5183感受态细菌中进行 同源重组。PacI酶切线性化重组质粒 pAd—H1．siRNA后，转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据 GFP报告基因的表达 观察重组病毒的产生和感染效率，用Westernblot检测人 SET蛋 白的表达水平。 结果 穿梭质粒 pShuttle·H1一siRNA经双酶 切和测序证实构建成功；重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达；获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。 经Westernblot检测 ，SET基因腺病毒载体 (AdH1一SiRNA／SET)感染组与未感染腺病毒载体组 (空 白对照)和感染对照腺病毒 载体组 (AdH1一SiRNA／NS)相比，SET蛋白表达水平显著降低 (P0．05)，抑制效率为50％ ～70％。 结论 成功构建了表达 人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1一siRNA／SET，并在AD293细胞中验证其抑制 SET蛋 白表达的作用，为进一步研究 SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。 【关键词】 SET基因；RNA干扰；重组腺病毒载体 [中图分类号] Q784 [文献标志码】 A [文章编号】 1008—8199(2010)02-0117-06 ConstructionandidentificationofhumanSETadenovirus．deliveredsiRNAvector XU Bo—qun。 LIYing，XUEKai，LIMei，MAXiang ，DIAOFei—yang，CUIYu—gui，LIUJia．yin ， (1．DepartmentofReproductiveMedicine，theFimtAffiliatedHospitalofNanfingMedicalUniversity，Nanjing 210029，China；2．FamilyPlanningInstituteofJiangsuProvince，Nanjing210036，Jiangsu，China；3．Depart— mentofObstetricsandGynecology，TheSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210011， Jiangsu，China) [Abstract] objective TheSET／TAF一113protein，a 基金项 目：国家 自然科学基金 ；江苏省科技厅项 目 productof the SET gene expression， is involve