六味地黄丸人血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制.pdfVIP

2014年 1月第 31卷第 1期 广州中医药大学学报 January2014，Vo1．31，No．1 JournalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine 103 六味地黄丸人血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制 刘娟 ， 周瑶2 张广献 ， 谭宇蕙 ， 肖建勇3 吴映雅 3 曾玲 ， 杜标炎 (1．广州中医药大学2011级硕士研究生 ，广东广州 510006；2．湖南中医药高等专科学校形态教研室，湖南株洲 412012； 3．广州中医药大学生化教研室，广东广州 510006；4．广州中医药大学病理教研室，广东广州 510006) 摘要： 【目的】探讨六味地黄丸主要入血成分处理的淋巴上清对大鼠肝癌细胞 CBRH7919缝隙连接功能的影响，以期阐明其增 强自杀基因疗法杀伤肝癌细胞效应的作用机制。【方法】取大鼠脾淋巴细胞，加入六味地黄丸的5种主要入血成分．体外培养 后取含药淋 巴上清，采用流式细胞术结合荧光示踪法分析其对细胞缝隙连接通讯功能 (GJIC)的影响；利用Westem blot 法检测含药淋巴上清对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响；利用GJ阻滞剂甘草次酸 (GA)观察阻滞 GJIC后， 含药淋巴细胞上清联合tk／GCV系统对细胞杀伤作用的影响。 【结果】流式细胞术结合荧光示踪法结果表明，占培养液 15％ (体积分数)的含药淋巴上清能促进大鼠肝癌CBRH7919细胞的GJIc功能；Westernblot法结果显示．含药淋 巴细胞上清能 提高大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达水平：GA阻断GJIC功能后．含药淋巴细胞上清联合tk／GCV系统对细胞杀 伤作用降低 【结论】六味地黄丸入血成分处理的淋巴上清可通过缝隙连接机制发挥对 自杀基因杀伤大鼠肝癌细胞的增效作 用 。 关键词：肝癌／中药疗法：六味地黄3L／药理学；入血成分；淋 巴上清；自杀基因；缝隙连接；肝癌细胞／病理学；细胞培养 中图分类号：R285．5 文献标志码：A 文章编号：1007—3213 (2014)01—0103—06 肝癌是最常见且死亡率较高的恶性肿瘤之一． 1．1 实验试剂 獐牙菜苷、马钱素、莫诺苷购 自 严重威胁人类健康 近年来人们对肝癌分子病理机 四川省维克奇生物科技有限公司 (獐牙菜苷批号： 理研究的不断深入．为正在兴起的肝癌基因治疗提 120928．马钱素批号 ：120820．莫诺苷批号 ： 供了理论依据 其中．自杀基因疗法更是取得了长 120416)：丹皮酚购 自上海融禾医药科技发展有限 足的发展 本课题组前期体内外实验研究表明六味 公司 (批号 ：090627)：5一羟甲基一2一糠酸购 自上 地黄丸对 自杀基因疗法治疗恶性肿瘤有增效作用． 海物竞化工科技有 限公司 (批号 ：A05S033)； 与免疫机制和缝隙连接机制相关[]王喜军等[一s] GJIC抑制剂甘草次酸 (CAS：1449—05—4，gly— 采用血清药物化学方法证明马钱素、莫诺苷、獐牙 cyrrhetinicacid。GA)购 自美国Sigma公司：GJIC 菜苷、5一羟甲基一2一糠酸和丹皮酚等5种化合物为 增强剂维 甲酸 (CAS：302—79—4，retinoicacid， 六味地黄丸主要入血成分．并通过实验论证了上述 RA)购 自美国Sigma公司：以上试剂纯度均大于 化合物是六味地黄丸药效的物质基础。本课题组前 98％ 液体培养基 DMEM和细胞培养用2．5g／L胰 期研究选用了上述 5种化合物．开展了六味地黄丸 酶均为美 国Gibco公司产品：四甲基偶氮唑盐 对 自杀基因疗法增效作用的物质基础研究．结果显 (MTY)、环氧鸟苷 (GCV)均为美国Sigma公司产 示上述5种化合物不能直接发挥对 自杀基因疗法增 品 ：荧 光 染 料 Calcein—AM (C3099) 和 DiI 效作用．但作用于淋巴细胞后．混合成分处理的淋 (V22885)均为美国Invitrogen公司产品：一抗小 巴细胞培养上清液对肿瘤 自杀基因疗法具有增效作