非洲猪瘟病毒VP73蛋白原核表达纯化及单克隆抗体制备与鉴定.pdfVIP

摘 要 非洲猪瘟（African swine fever，ASF ）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV ）感染猪引起的急性、热性、烈性、高度接触性传染病，二 十世纪中期以来，已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，并在近几年内蔓延 至欧亚接壤的格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆以及俄罗斯境内，一旦侵入我国， 危害极大。 VP73 蛋白是 ASFV 的主要结构蛋白，由 B646L 基因编码，分子量约为 73 ku。 VP73 是病毒粒子二十面体衣壳的重要组成部分，产生于病毒感染的晚期，约占整 个病毒粒子蛋白的 32%。VP73 蛋白作用主要体现在非洲猪瘟病毒结合进入受体细 胞过程中和病毒粒子衣壳的产生两方面。大多数非洲猪瘟病毒毒株都有很强的毒 力以及相反地很低的免疫原性。有研究表明，各地区的毒株产生的 VP73 抗体相 应抗原表位都很保守，VP73 蛋白具有稳定的抗原性，是血清学检测和免疫制剂常 用蛋白。VP73 参与了病毒的吸附过程，针对 VP73 的抗体可以阻断病毒与巨噬细 胞的结合。此外 VP73 还参与了病毒装配过程中 pp220 和 pp62 的加工。 基于此背景，本论文根据已发表的非洲猪瘟病毒 VP73 基因核酸序列的主要 抗原表位区，自行设计一对引物，以阳性质粒 pMD18T-VP73 为 PCR 扩增模板，进 行 PCR 扩增，获得了 612 bp 大小的核酸片段，将其克隆入原核表达载体 pET32a(+)，构建原核表达载体 pET32a-vp73。鉴定正确的原核表达载体转化至宿 主菌 E.coli BL21 （DE3），挑取阳性克隆菌落培养，IPTG 诱导后裂解菌体作 12% SDS蛋白电泳分析，出现大小约 43 ku 的融合蛋白条带。融合蛋白纯化后经 Western blot 分析，表明该蛋白具有较好的免疫原性。通过摸索表达条件，优化 了重组 VP73 蛋白的表达：用含 100 mM 氨苄的 LB 液体培养基 37℃振摇培养，待 菌生长至 0D 值为 0.6 时，用终浓度为 0.8 mM 的 IPTG 诱导，于 37℃振荡培养 5 h。 对离心收集后的菌体上清和沉淀进行 SDS分析表明，融合蛋白以包涵体的 形式存在，经超声波裂解菌体后，分离包涵体并离心、洗涤，再用 6 M 尿素溶解 包涵体，最后用试剂盒纯化融合蛋白。 以原核表达并纯化的非洲猪瘟病毒 VP73 蛋白为免疫原，按常规方法免疫 BALB/c 小鼠，细胞融合前建立了间接 ELISA 方法筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反 应条件。即：抗原包被浓度为 2 μg/mL，以 1:1000 稀释的阴、阳性血清分别作为 阴、阳性对照，反应条件均为 37℃ 1 h。取免疫后的小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤 细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经三次有限稀释法克隆，最终获得一 株持续且稳定分泌抗 VP73 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 1C8。对该株 杂交瘤细胞株的稳定性、亚类、腹水效价、特异性和生物学活性进行了鉴定。结 果表明，所获得的单克隆抗体稳定性好；经亚类鉴定，该株杂交瘤细胞分泌的抗 5 体类型为 lgGI 亚类；其腹水效价达到 1.024×10 以上；该株单抗特异性针对目 的蛋白而非针对组氨酸标签蛋白，且与其他病毒的蛋白无交叉反应，特异性较好。 关键词：非洲猪瘟病毒；VP73 蛋白；原核表达；单克隆抗体； Prokaryotic Expression and Purification of Protein VP73 in African Swine Fever Virus, and Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies Abstract African swine fever (ASF) is a highly contagious and fatal hemorrhagic viral disease of domestic pigs, and caused by