单细胞凝胶电泳对人类肝癌细胞的研究.docVIP

通过单细胞电泳观察受重离子辐射的人体肝癌细胞的DNA损伤 摘要 目的：现在很多国家都已经发展了癌症的重离子疗法，特别是在GSI(Gesellschaft fur Schwerionenforschung mbH，Darmstadt，Germany)已经取得了引人注目的成果，但是由于重离子运行方式的复杂性阻碍了实际运用，因此基础理论仍然需要更深的研究。在这篇文章中，我们将使用单细胞凝胶电泳来测量重离子辐射对于SMMC-7721细胞的基因毒性。X射线、γ射线、紫外线以及快中子辐射造成的DNA损伤资料已经相当完备，但是迄今为止关于重离子在这方面影响的研究很少。据此，我们尝试通过彗星实验来检测重离子辐射对肝癌细胞的影响，同时建立一个临床可用的重离子癌症疗法的数据库。 方法：本次实验所选用的材料是人体肝癌细胞，在中国兰州重离子加速器接受80MEV/U的辐射，剂量分别为0,0.5，1,2,4,8Gy，然后立即使用凝胶电泳检测DNA损伤，每个剂量的样品选取100-150个细胞，记下慧尾的长度和数量，并用EXCLE分析数据。 结果：在受到0.5Gy到8Gy的辐射处理后，我们从彗星实验图像发现SMMC-7721细胞都受到损坏。慧尾的长度和尾距都随着剂量的增加而增加，而出现慧尾的细胞的数量也随着剂量的增加而增多。当剂量达到2Gy时，接近100%的细胞都受到损伤。此外，慧尾的长度和距离都显示出了线性关系。 结论：通过清晰的彗星实验图像，我们的实验证明彗星实验可以用来测量重离子对DNA的损伤。同时DNA损伤和重离子的剂量有明显的对应关系，而且SMMC-7721细胞对有很大的辐射敏感度。剂量改变而引起DNA的不同的反应可以佐证彗星实验对重离子诱变引起的DNA损伤检测也是有效的。 引言 在过去的几十年里，从基础的物理、化学到生物肿瘤和实验室放射疗法开始逐步发展，辐射研究已经成为一个专门的分支学科。虽然关于X射线和γ射线的放射生物学影响已经有了广泛的研究，但是关于重离子束的放射生物学影响的研究却少之又少。随着人类足迹向外太空的迈进，关于高线性能量转移的研究吸引了越来越多的目光。随着二十世纪七十年代中期LBL首次运用重离子来治疗癌症，美国已经得出了比传统的软组织瘤、骨癌、前列腺癌的放射疗法更加有前途的结果。现在许多国家的科学家都已经设计出加速器来产生重离子束并用于临床治疗，并且已经开始进行一些重离子癌症疗法的初步研究，比如，碳、氖、氧和氩。 本研究的目的是为了通过彗星实验研究重离子对DNA损伤的诱导作用，其理论值将会同X射线、γ射线以及其他辐射所造成外部影响比较，并据此建立一个可供临床使用的疗法数据库。 碱性状态下的彗星实验由于其简单性和准确性已经成为一种分析由化学和物理因素引起的DNA损伤的主流方法。DNA损伤包括DNA链的断裂，碱不稳定位点，修复中心的不完全剪切。虽然直接的DNA损伤程度可以碱性洗脱、切口平移、碱基单细胞凝胶电泳来加以估测，但是单细胞凝胶电泳比前两者表现出更好的敏感性。单细胞凝胶电泳已经被证明在敏感性方面比微核的胞质分裂阻断检测有令人瞩目的优势。更重要的一点是单细胞凝胶电泳是一种电泳技术，可以进行单个细胞的DNA损伤和DNA修复率的检测。因此受重离子辐射的细胞所产生的DNA的急性损伤和慢性损伤可以反映成为最初损伤或者残留损伤，前提是如果时间允许酶去修复DNA的断链。在我们实验室，我们的主要研究方向就是探究重离子对肿瘤细胞的放射生物学影响。以前的实验我们主要进行的是细胞存活测量但是不能在分子水平上解释敏化辐射的潜在机理。为了检测受重离子辐射的细胞DNA的放射生物学影响，单细胞凝胶电泳，也称为彗星实验被用来直接测量细胞的DNA损伤。 实验材料和方法 细胞和细胞培养 人类肝癌细胞株SMMC-7721购买自上海第二军医大学，我们用添加了15%小牛血清的RMIP-1640培养基在标准恒温箱中于37℃下培养。每天换液1次，每2～3天消化传代1次，这么做是为了保证细胞在良好的条件下生长。在接受辐射的前两天，细胞会被转移到35mm的培养皿中，每个培养皿含有2ml的细胞悬液，细胞的密度是每毫升50000个，每一个剂量有五个平行样。在接受辐射之前，每个培养皿中的细胞都会在倒置的光学显微镜下接受检查来选择生长状况和密度都良好的材料，此时RMIP-1640 Medium培养基将会被去除，只有Dulbecco氏磷酸盐缓冲培养基来维持细胞在接受辐射前的湿度。 离子束的选择 我们选用的是离子束，能量为80兆伏，电流强度为0.00136纳安。细胞受到的辐射的吸收剂量分别为0.5、1、2、4、8Gy。细胞受到的辐射剂量由气体电离箱测量。 单细胞悬液的制备和彗星实验 辐射结束之后，洗涤和收集细胞，在单细胞悬液中添加Dulbeeco氏磷酸盐缓冲液后，最终的