菌落多重PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌.pdfVIP

动物医学进展 。2O10，31(1)：6—9 ProgressinVeterinaryM edicine 菌落多重 PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性 巴氏杆菌 李伟杰，赵 耘 ，杜昕波，康 凯，陈 敏 (中国兽医药品监察所 ．北京 100086) 摘 要：参照文献报道 的多杀性 巴氏杆 菌 KMT1基 因和荚膜 生物合成位点 hyaD—hyaC、bcbD、debF、 ecbJ、fcbD基因的序列合成了6对特异性引物，建立 了多杀性 巴氏杆菌种和型的菌落多重PCR方法。结果 表明，本所保藏的A、B、D、E、F各型多杀性巴氏杆菌均扩增 出了相应的预期片段 ，PCR结果与Biolog鉴定 结果和Carter氏间接血球凝集试验结果相一致；而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希茵、 猪链球菌和粪肠球菌的扩增均为阴性 。 关键词 ：多杀性 巴氏杆菌；茵落多重 PCR；荚膜血清型；Biolog鉴定；Carter氏间接血凝试验 中图分类号：$852．612；Q789 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2010)01—0006—04 多杀性 巴氏杆菌 (Pasteurellamuitocida，Pro) 球菌CVCC606、粪肠球菌A20由中国兽医药品监察 是具有异质性特征 的病原菌亚种群 ，常引起牛、猪 、 所菌种保藏 中心提供 。 鸡、兔等家养动物和野生动物 以败血症及呼吸系统 1．1．2 主要仪器及试剂 三洋 CO2培养箱，Biolog 疾患为主的疾病 j。目前认为不同菌株之问在宿 细菌鉴定仪，EppendorfPCR仪，北京六一电泳槽 ， 主亲嗜性、致病力、碳水化合物发酵、菌落形态和抗 WeahecDolphin-chemi凝胶成像系统，上海精宏隔 原特异性等方面具有 明显差异[1]。由于荚膜血清 水式培养箱；TaqDNA 聚合酶，1O×PCRbuffer， 型决定病原菌的免疫原性，各血清型之 间交叉免疫 dNTP，DNAMarkerDL2000和琼脂糖购 自宝生 保护性较低 ，对该致病菌进行荚膜分型就显得尤为 物工程 (大连)有 限公司；染料 Goodview购 自北京 重要L1]。1984年 CarterGR等[2提 出多杀性 巴氏 赛百盛基因技术有限公司。 杆菌血清型的标准定名，分为A、B、D、E和 F5个荚 1．2 方法 膜血清型。TownsendKM 等 研究表 明，KMT1 1．2．1 菌株培养 将冻干保存 的多杀性巴氏杆菌 基因是 Pm种特异性的片段 。而荚膜生物合成位点 用马丁 汤溶解 后，接 种改 良马丁琼脂 斜面 (含 hyaD—hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、febD分别是 A、B、D、 40mL／I马血清和 1g／L血红素)，37℃过夜培养； E、F血清型高度特异性的基因 。本试验拟对上述 支气管败血波氏杆菌、猪链球菌用马丁汤溶解，接种 特定的基因序列选择不同引物进行扩增，研究多杀 血琼脂斜面，37℃过夜培养 ；大肠埃希菌、粪肠球菌 性巴氏杆菌种的鉴定和荚膜分型，以及与 Biolog鉴 用普通 肉汤溶解 ，接种普通琼脂斜面，37℃过夜培 定和传统血凝抑制试验的符合率。 养；胸膜肺炎放线杆菌用 TSB(含 80mL／L小牛血 1 材料与方法 清和 0．2g／LNAD)溶解 ，接种 TSA(含 80mL／L 1．1 材料 小牛血清和 0．2g／LNAD)斜面，体积分数为 5 1．1．1 菌株 多杀性 巴氏杆菌参考菌株 CVCC390 CO。环境 中37℃过夜培养。取各菌种的斜面培养 (A 型 )、CVCC391(B 型 )、CVCC392(D 型 )、 物划线接种相应 的平板 ，37℃培养 24h，单菌落直 CVCC393(E型)、CVCC395(F型)和多杀性 巴氏杆 接作为PCR反应的模板进行菌落 PCR。 菌 C44—2、C44—10、C44—18、C44～44、C44—49、C45—11、 1．2．2 菌株 的Biolog鉴定 Biolog鉴定操作见参 C46