贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立.pdfVIP

动物医学进展。2O10，31(t)：54—57 ProgressinVeterinaryM edicine 贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重 PCR检测方法的建立 谢丽基 ，谢芝勋 ，庞耀珊 ，刘加波 ，邓显文 ，谢志勤 (广西兽医研究所 ，广西南宁 530001) 摘 要：根据基 因库中单孢子 虫和折光马尔太虫的基因序列，分别设计 了2对特异性 引物，通过对二重 PCR扩增条件的优化 ，研究建立 了可同时检测鉴别这 2种原虫的二重 PCR。对 同一样品中的单孢子虫和折 光马尔太虫模板DNA进行扩增，得到 2条大小与试验设计相符的244bp(单孢子虫)和 478bp(折光马尔太 虫)的特异性扩增带，而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧茵 等病原体的检测 ，结果均为阴性 。敏感性试验表明，该技术最低能检测到 10Pg的单孢子虫和折光马尔太虫 DNA 。 关键词：单孢子 虫；折光马尔太虫；二重 PCR 中图分类号 ：$852．723 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2010)01—0054—04 随着养殖规模 的 日益扩大及养殖密度的增高 ， 1 材料与方法 贝类的病害也频繁 出现。 目前 ，危害最严重 的贝类 1．1 材料 原虫有单孢子虫 (Haplosporidium spp．)和折光马 1．1．1 菌株和DNA 嗜水气单胞菌和荧光假单胞 尔太虫 (Marteiliare．fringens)。单孢子虫主要感染 菌均购 自中国农业部动植物病原库；折光马尔太虫、 血细胞 ，结缔组织和消化道上皮 ，可引起较高的死亡 派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌 率[1]。马尔太虫可引起 贝类消瘦，消化道变色 ，停 等由广西壮族 自治区兽医研究所生物技术室提供 ； 止生长并死亡 。 尼氏单孢子虫、沿岸单孢子虫 的DNA 由美 国维吉 单孢子虫和折光马尔太虫 的传统检测方法有电 尼亚海洋科学研究所的 StokesN赠送 。 镜观察 、组织细胞学检查和原位杂交等 。这些方法 1．1．2 主要仪 器与试剂 PCR仪为美 国Perkin 费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局 ElmerCetus公司生产的 PE9600仪 。PCR试剂盒 限性__5]。病原检测、筛选建立无特定病原体的健康 及 PMD18一T试剂盒购 自宝生物工程 (大连)有 限公 群，仍然是 目前预 防与控制这些原虫病的最有效办 司；DNA片段回收试剂盒购 自BioDev公司；海洋动 法。PCR方法具有操作简便 、敏感性高 、特异性强、 物组织基因组 DNA提取试剂盒购 自天根公司。 重复性好等优点，已成为动物病原检测的重要方法。 1．2 方法 至今仍未见有应用二重 PCR技术对 贝类单孢子虫 1．2．1 引物设计与合成 根据单孢子虫和折光马 和折光马尔太虫进行检测和诊断的报道 。本试验设 尔太虫的基 因保守序列 ，通过 Blast验证 ，设计 了2 计