实验六间隔法测定过氧化物酶的活力(原理清晰,步骤清楚).docVIP

一. 目的??? 掌握间隔法测定过氧化物酶活力的原理及操作方法二. 原理??? 过氧化物酶（peroxidase，POD，EC 1.11.1.7）是以铁卟啉为辅基的氧化酶，催化H2O2氧化某些酚类、芳香胺和抗坏血酸等还原性物质。它广泛分布于生物界，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，如清除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白以及促进植物细胞木质素的形成等。??? 本实验以愈创木酚（邻甲氧基苯酚）和H2O2为底物，过氧化物酶催化H2O2放出新生态氧，使无色的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚，反应式如下： ??? 过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，该产物在460nm有最大的光吸收，故可通过测定A460的变化来测定过氧化物酶的活力。这里规定，一个过氧化物酶活力单位为在室温、pH5.4的条件下，酶反应体系中每分钟A460的增加值为1所需的酶量。??? 活力测定时，酶反应在分光光度计的比色杯内进行，由于酶反应产物增加而使A460增加，通过定时间隔记录可获得一组A460值。以时间为横坐标，A460值为纵坐标进行线性作图（或用统计方法求得回归方程），进而计算A460的变化速率（DA460·min-1），最后计算每克鲜重样品中过氧化物酶活力的大小。三. 实验材料及设备1. 材料??? 禾本科植物叶片2. 仪器??? 电子天平? 高速冷冻离心机? 分光光度计? 冰浴3. 器材??? 刻度试管：?? 10mL×1??? 移 液 管：?? 5mL×1??? 微量进样器：200ml?? 1000ml??? 烧??? 杯：?? 250mL×2?? 50mL×1??? 离 心 管：?? 7mL×1（带盖）??? 滴??? 管：?? 2??? 洗 耳 球：?? 2??? 硫 酸 纸??? 研钵、剪刀、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制??? 1. 酶提取缓冲液??????? 50mmol/L、pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，内含5mmol/L亚硫酸氢钠和1%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)（临用前加）。??? 2. 酶活力测定缓冲液??????? 0.1mol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液??? 3. 愈创木酚溶液（0.25%W/V）（溶于50%乙醇中）（临用前配制）??? 4. 溶液（0.75%）（临用前配制）五. 操作步骤??? 1. 酶液的制备??? (1) 取材：称取0.5g左右叶片，记下实际质量?????? g。??? (2) 研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的酶提取缓冲液5mL，置冰浴上充分研磨。??? (3) 离心：匀浆液全部转入塑料离心管，于4℃下、以10,000g离心15min。上清液全部倒入试管，此上清液即为粗酶液，待测。??? 2. 酶活力测定??? (1) 将分光光度计预热10min，波长定于460nm处。??? (2) 在玻璃比色杯内，先加入2mL醋酸-醋酸钠缓冲液和1mL 0.25%愈创木酚溶液，??????? 再加入0.05mL或0.1mL酶液（视酶活力大小而定），最后加入0.1mL 0.75%溶液，用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀。??? (3) 立即把比色杯插入比色架，关盖。迅速把A460调至0并开始记时，每隔30秒读取并记录A460值，共读3分钟。（注：酶液加入量一般控制在5min内使A460达到0.5～0.8为宜）六. 结果处理??? 1. 以时间为横坐标，A460值为纵坐标，对所得数据进行线性作图（或用统计方法求回归方程）；??? 2. 求出上图中所作直线（或回归方程）的斜率，即ΔA460·min-1，此为反应的初速度；??? 3. 求出每克鲜重植物样品中过氧化物酶的活力单位，以Ug-1FW表示。七. 思考题??? 1. 酶活力测定为什么必须测定酶反应的初速度？??? 2. 在本实验的酶提取和酶活力测定时，为什么用不同的缓冲液？