家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索_医学论文.docVIP

家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索_医学论文 家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索_医学论文 作者：张小华 王跃嗣 牛新华 【摘要】 目的 构建铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）基因缺失的酿酒酵母菌株, 为进一步以酵母为模型开展家族性肌萎缩硬化症发病机制及防治研究奠定基础。方法 运用LFHPCR构建了带有遗传霉素抗性基因（KanMX4）的SOD1基因中断框，转化酿酒酵母BY5677，以添加G418的平板筛选出SOD1基因缺失菌株，并经PCR鉴定。结果 PCR扩增证实SOD1基因已被成功敲除；与野生菌株相比，SOD1基因缺失菌株生长缓慢。结论 成功构建了SOD1基因缺失的酿酒酵母菌株。 【关键词】 家族性肌萎缩硬化症；酿酒酵母；SOD1；LFHPCR 【Abstract】 Objective To construct the SOD1 gene deletion mutant of Saccharomyces cerevisiae and lay a foundation for studying the pathogenesis and treatment of familial amyotrophic lateral sclerosis based on the yeast model.Methods The SOD1:KanMX4 gene deletion fragment was constructed by long flanking homology LFHPCR and transferred to yeast strain BY5677. The SOD1 gene deletion mutant was selected on plates containing G418 and confirmed by PCR.Results The PCR analysis showed that SOD1 gene in the yeast strain BY5677 was deleted，compared with the wildtype strain, the SOD1 gene deletion mutant grew slowly. Conclusion An SOD1 deletion mutant was successfully constructed. 【Key words】 familial amyotrophic lateral sclerosis，Saccharomyces cerevisiae，SOD1，LFHPCR 家族性肌萎缩侧索硬化症（familial amyotrophic lateral sclerosis, FALS）是一种进行性致死性神经系统变性疾病，5%～10% 的患者有家族性，其主要临床表现是肌肉逐渐萎缩无力，患者最后会因呼吸衰竭而死亡［1，2］。目前研究认为FALS的发病与铜锌超氧化物歧化酶(Cu／Zn superoxide dismutase，SOD1)基因突变有关，但是其具体机制尚不清楚［3］。SOD1基因从酵母到人具有高度的保守性［4］，作为一种模式生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已经广泛的被运用于人类遗传疾病研究［5，6］。本文利用LFHPCR技术,构建SOD1基因缺失的酵母菌株，对家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的建立进行了探索。 1 材料与方法 1.1 菌种和质粒 酿酒酵母BY5677 (MATa leu2～3/112 ura3～1 trp161 his3～11/15 ade2～1 can1～100 GAL SUC2 mal0) 由日本酵母遗传中心提供。酵母质粒pLEJ009由美国明尼苏达州大学David T. Kirkpatrick教授惠赠。 1.2 主要试剂和仪器 pfu DNA聚合酶、胶回收试剂盒、G418购自北京全式金公司。 酵母粉、蛋白胨、鱼精DNA购自上海生工公司，其它化学试剂均为国产分析纯。引物委托上海博亚公司合成。 1.3 培养基 酵母用YEPD培养基：葡萄糖 20 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，加蒸馏水至1 000 ml，pH 6.0～6.5, 8磅30 min灭菌。固体培养基添加2%(W/V)的琼脂。 1.4 酵母基因组DNA的提取 取15 ml的酵母过夜培养物，离心收集菌体，用0.5 ml的无菌水悬浮，13 000 r/min离心30 s，加200 μl的裂解缓冲液［2%(V/V) Triton X100，1%(V/V) SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L TrisCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0