小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达_医学论文.doc免费

小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达_医学论文 小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达_医学论文 作者：周强，周巧梅，李云，庞庆丰，曾因明 【摘要】 目的 在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因。方法 用Nsi Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A（nisA）启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒；经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中，转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用乳链杆菌肽（nisin）诱导白细胞介素-12表达，SDS－PAGE、Western blot鉴定表达产物；用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-12的量。结果 建立了白细胞介素-12乳酸菌基因表达系统。在nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80 ng/Ｌ。结论 乳酸乳球菌能够表达一定数量的小鼠白细胞介素-12。 【关键词】 白细胞介素-12；基因克隆；乳酸乳球 白细胞介素-12（interleukin 12， IL-12）主要由B 细胞、T 细胞、单核巨噬细胞产生的一种具有多种功能的细胞因子。它能够促进NK细胞、T 细胞的增殖和杀伤活性， 诱导γ-干扰素等细胞因子的产生， 调节Th1 细胞的发育， 具有良好的临床应用前景。目前已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗哮喘的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验阶段［1~5］。人重组IL-12 （recombinant human interleukin-12， rh IL-12）的临床试验提示rh IL-12在治疗肿瘤、病毒感染性疾病及哮喘中具有肯定的效果。国内、外均采用基因工程的技术使用逆转录病毒和重组腺病毒载体介导的方法在COS - 7细胞、肝癌细胞株中进行体外表达得到rh IL-12［6-7］。但存在着成本昂贵、操作技术复杂、表达量较低、需多次提取纯化才能使用等缺点。而如果将携带rh IL-12的逆转录病毒或重组腺病毒载体静脉注射或局部注射使rh IL-12在体内表达，则存在的主要问题是:转移效率低，免疫原性强，外源基因在细胞中只能短期表达［8-9］。因此寻找一种简便而又实用的开发rh IL-12的方法使其尽快成为一个新的药物非常重要。近年来，人们在研究乳酸菌的过程中所建立的乳酸菌基因表达系统为有效地开发和利用rh IL-12提供了新的机遇。本研究报道了小鼠 IL-12 基因在食品级微生物乳酸乳球菌中的活性表达，从而为以乳酸乳球菌为基础的IL-12应用研究提供依据。 1 材料和方法 1.1 质粒、菌株及培养条件 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ9000和pSEC-E7质粒为法国农业科学院Luis教授赠送，大肠杆菌DH5α、pGEM-IL-12载体为本实验室保存；其中大肠杆菌DH5α用于质粒pSEC-E及其衍生质粒保存或扩增的标准菌株，乳酸乳球菌NZ9000 用作IL-12基因重组表达质粒pSEC-IL-12的表达菌株。大肠杆菌用LB培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。氨苄青霉素使用浓度为100 mg/L，氯霉素使用浓度大肠杆菌为10 mg/L、乳酸乳球菌为5 mg/L。IL-12酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海森雄公司。 1.2 重组质粒的构建及转化 重组质粒构建如下：用Nsi Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-IL-12 质粒后，与经同样酶切的含有nisA启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC- IL-12质粒，pSEC- IL-12质粒含有Usp45 信号肽。乳酸乳球菌转化采用电穿孔转化法，电穿孔仪为美国Bio-Rad公司，脉冲参数为1.25 kV/mm，25 μF和200 Ω。重组质粒经电击转化乳酸乳球菌NZ9000，转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再从重组乳酸乳球菌中提取质粒 pSEC- IL-12，进行电泳鉴定。 1.3 小鼠HO-1基因在乳酸乳球菌中的诱导表达 含重组质粒pSEC- IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在脑心浸液培养基中30℃静置培养过夜,用新鲜培养基1∶50稀释，培养至OD600＝0.5～0.6时，加入诱导物Nisin至终浓度10 mg/L，继续培养3 h。终止培养后，取2 ml培养菌液，4℃、8 000 r/min离心5 min，上清液浓缩50倍后经15％SDS电泳分离后，通过Bio-Rad 印迹仪转移至硝酸纤维素膜上作Western- blot。以空载体Lactococcus lactis为对照。取1 ml培养菌液用ELISA试剂盒测定IL-12的产量。 2 结 果 2.1 IL-12在细菌中的转化，提抽，鉴定 将pSEC-IL-12转化至DH5α中