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应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果_医学论文 应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果_医学论文 作者：谢书阳 王萍玉 岳真 李有杰 张公 【摘要】 目的 用绿色荧光蛋白（GFP）反映RNA干扰（RNAi）载体的转染率，以研究RNAi载体的抑制效果。方法 将GFP基因和RNAi片段（特异性针对Bcl基因）连接至pC1载体上，构建共表达载体GFP/RNAi及其对照载体，转染293细胞，用荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞的GFP转染率，并用TR分析RNAi抑制Bcl表达的效果。结果 在293细胞中，GFP的转染率可达85%以上，此时观察到RNAi有效的抑制了Bcl的表达。结论 在RNAi实验时，可选用GFP等标记基因作为载体转染率的判断标准，以进一步判断RNAi的作用效果。构建的RNAi载体有效的抑制了Bcl的表达，为下一步抑制肿瘤细胞的生长提供科学资料。 【关键词】 绿色荧光蛋白；RNA干扰；Bcl；细胞转染 【Abstract】 Objective Studying the suppression effect of RNAi by using green fluorescence protein (GFP) to reflect the transfection rate.Methods GFP gene and RNAi segment specific to Bcltimated from GFP by using fluorescence microscopy as well as FACS analysis, and the suppression of Bcl2 mRNA expression was detected by RTPCR.Results The transfection rate was above 85% from detection of GFP positive cells, and the Bcl2 mRNA expression was also decreased to 50% as its control group.Conclusion The marker gene (such as GFP) may be used to reflect transfection rate in RNAi experiment, because the transfection rate is important for the inhibitive effect of RNAi. The suppression of Bcl2 expression is crucial to inhibit proliferation of tumor cells. 【Key words】 GFP,RNAi, Bcl 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是来源于发光水母(aequorea victoria)的一种功能独特的蛋白质。GFP受光激发产生荧光是一个特异性的独立过程，在异源细胞内融合表达后可自发环化成熟，自发产生荧光且对异源细胞内的生理过程无干扰，可应用于活体细胞的适时检测。GFP是一种稳定蛋白，即使在较高浓度的强毒性药剂(如HCI胍、尿素、硫酸盐等)中延长孵育时间，荧光仍可持续存在［1］。研究证明EGFP是一种良好的报告基因和筛选标志［2］，为进一步研究应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统奠定了基? １狙芯垦∮肎FP作为标记基因，构建GFP/RNAi表达载体，用GFP的转染率反映细胞转染率，进一步判断RNAi对目的基因的作用效果，为体外进行RNAi实验提供科学的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 脂质体2000购自Invitrogen公司，pC1载体购自Promega公司，RNA 提取试剂盒购自U公司，NheI、SalI等酶、逆转录酶购自TaKaRa公司，293细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司，GFP表达载体（Invitrogen）。测序及引物合成由山东吉正科技有限公司完成。 1.2 方法 1.2.1 RNAi元件的设计和实验所用载体：依赖RNA 聚合酶Ⅲ的H1启动子通过PCR从人基因组DNA中扩增获得［3］。Bcl干扰片段的设计参考Tiscornia等报道［4］进行。正向片段序列为：5’GCTCCCGCGATAGTGATGAAGTACATCTTCAAGA GAGATGTACTTCATCACTATCTTTTTGGAAAA3’，反 向片段序列为5’ TATCGGG3’；两片段缓慢退火后，将干扰片段克隆到T载体上，得到干扰载体Ti，并测序证明干扰片段序列正确。