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原生质体的培养??? 原生质体（Protoplast）:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞 。 一、原生质体的应用? ???由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为 有利的试验材料。原生质体可以用于下面几种研究。 ?用作细胞杂交服务于作物改良 用作遗传转化的对象? 研究细胞壁的发生过程 筛选突变体 膜的结构、运输、激素接受位点等的研究 用于分离细胞器和大分子 种质资源保存 二、原生质体分离、纯化 原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。 （一）分离方法 机械法分离 缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力 酶法分离???? Cocking最早开展这方面研究，克服了机械法分离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。 （二）影响原生质体分离的因素（酶法） ??从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。原生质体分离时主要应考虑 取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。 1.?? 外植体来源:???? 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspension cultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。 叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。另一个分离原生质 体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒.?选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体。 2. 酶液组成和浓度 ： 纤维素,占壁干重的25-50% 植物细胞壁由三个主要成分构成?? 半纤维素,? 平均53%，果胶质,5% 用来分离植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶。纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶的作用是降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开。? 常用的酶制剂及其生产厂家有： 纤维素酶有Cellulase Onozuka R-10 （Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本），Cellulase Onozuka RS （Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd., Nishinomiya, 日本），Cellulase （Sigma），Driselase （Kyowa Hakko Kogyo Co.，日本）。果胶酶有Pectolyase Y23 （Kikkoman Shoyu Co., Lte. Nishinomiya，日本），Macerozyme（Yakult Biochemicles Co.，日本），Pectinase（Serva）等。半纤维素酶有Rhozyme Hp-150 （Rohm and Haas Co. inde. 美国宾西法尼亚州）。大多数植物分离原生质体时，纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有很多例外。? 3.? 渗透压： 原生质体操作需要在一定渗透压存在下进行，常用的配制分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为CPW液，CPW盐成分为： ????????? KH2PO4????????????? 27.2mg/L ??? ???????KNO3???????????????101.0mg/L ????????? CaCl2.2H2O?????? 1480.0mg/L ???????? MgSO4.7H2O????? 246.0mg/L ?????????? KI????????????????0.16mg/L ????????CuSO4.5H2O????? 0.025mg/L pH 5.8 根据渗透剂的浓度和成分可分为以下几种培养基: ???????????????????? CPW13M:? CPW盐+13%甘露醇(mannitol) ?????????CPW9M: CPW盐+9%甘露醇 ?????????????CPW21S: CPW盐+21%sucrose ????????CPW0M: CPW盐溶液。 ???多数情况下