超声波处理提高花生遗传转化率地研究.pdfVIP

超声波处理提高花生遗传转化率的研究 徐勤青h 刘风珍1 万勇善1 王圣林2 (1．山东农业大学农学院，山东泰安271018；2．东阿县职教中心，山东东阿252201) 摘要：试验以花生栽培品种丰花2号胚小叶为外植体，在根癌农杆菌侵染外植体时 对花生遗传转化效率的影响。结果表明，超声波处理6min能有效提高花生遗传转化率。转 基因苗的PCR检测初步证明目的基因已整合到花生基因组中。 关键词：花生；根癌农杆菌；遗传转化 花生是世界上重要的油料和经济作物，利用植物基因工程技术进行遗传改良，是提 S．和 高花生产量，改善品质，增强抗病虫和抗逆性的重要途径。自1994年Eapen GeorgeL．…首次报道获得花生转基因植株以来，农杆菌介导途径进行花生基因转化研 究已有较多成功的报道，基因转化的技术体系不断完善。国内方小平等嵋1(1996)用 花生4d龄小叶作受体，通过农杆菌感染，将外源基因导人花生中获得再生转基因植株。 刘风珍∞3报道了利用农杆菌介导转y—tmt基因获得转基因植株。尽管目前已将抗除草 剂、抗病毒等基因导人花生，但是转化效率比较低。农杆菌介导的遗传转化中，农杆菌 侵染外植体一定时间，才能使农杆菌吸附在外植体的表面，此过程中许多因素对转化效 率有较大的影响。农杆菌转化时，将转化材料浸在农杆菌悬液中，超声波的空化效应过 程中气泡闭合形成瞬间高压，造成许多微损伤，有利于农杆菌进入外植体1。姚春 娜¨1在农杆菌转化黄瓜的试验中用超声波处理25min时，子叶和下胚轴的转化率分别比 对照高14．4％和9．8％；邹湘辉1以8～lOd苗龄的无菌苗叶片中段为外植体，预培养 3d后超声波处理2min，芽点诱导率比无超声波处理高19．9％。 本试验选择花生栽培品种丰花2号的胚小叶作为外植体，研究了超声波处理对农杆 菌介导花生遗传转化效率的影响，并将y—tmt基因导入花生基因组中。 1材料与方法 1．1菌种和质粒 根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，其中含有植物表达载体质粒pG- BVE，该质粒包含与CaMV35S启动子连接的拟南芥y-tmt基因和筛选标记基因bar口1。 1．2外植体的获得 剥取花生(Arachis L．)栽培品种丰花2号种子完整的成熟胚，70％酒精 hypogaea 18h，将浸泡的胚在无菌条件下切取小叶片，接于A培养基(成分：MS无机盐+B5有 t作者简介：徐勤青，女，作物遗传育种专业硕士研究生，主要从事花生生物技术研究。 230 生物技术固 机物+4．5mg／LBA+0．7mg／LNAA+3％蔗糖+0．8％琼脂，pH值5．8)，预培养4d。 1．3农杆菌介导花生转化的步骤 含Ti质粒的农杆菌的活化及培养按文献∞1的方法。用液体MS培养基悬浮农杆菌 至OD。。。=0．65，将预培养的受体材料悬浮于菌液中振荡浸染15min，取出用滤纸吸干 表面液体，接于A培养基上，16h光N／d，28qC共培养。共培养4d后，外植体用无菌 水洗4次，在含头孢霉素(Ce)650mg／L的改良MS液体培养基中振荡杀菌6h，吸干 表面水液，转接在含Ce500mg／L的A培养基上继续培养25d后，胚小叶诱导的丛生芽 转入含Ce500mg／L的B培养基(成分：MS无机盐+B5有机物+5mg／LBA+3％蔗 糖+0．8％琼脂，pH值5．8)中诱导芽分化。 1．4超声波处理对转化效率的影响试验 侵染时把三角瓶放于超声波清洗器(功率50W，工作频率40kHz)中央进行超声 10min、15min，外植体在菌液中侵染时间15min。每个处理侵染约240个外植体，于 30d、60d时观察胚／],nf分化芽丛、褐化情况，分化苗筛选60d时调查抗性苗数。 1．5抗性苗的筛选 芽丛上分化出苗伸长至2～3cm时，将苗切下，转人生根培养基(MS无机盐+B5 有机物+3％蔗糖+0．8％琼脂，pH值5．8)中诱导生根，待根系发育良好长成苗后， 转入含PPTl mg／L的生根培养基进行筛选。各调查项目的计算公式如下： 抗性苗率(％)=(筛选后存活的苗数／筛选苗数)×100 1．6转基因植株的PCR检测 目的基因的引物设计及